¦
¦ ¦ ¦ ¦нервные клетки ¦
¦21¦Метахромати- ¦арилсульфатаза А ¦стволовые клетки¦ ПВ
¦ ¦ческая лейко- ¦ ¦крови, ¦
¦ ¦дистрофия ¦ ¦нервные клетки ¦
¦22¦Синдром Леш- ¦гипоксантин-фосфо- ¦нервные клетки ¦ ПВ
¦ ¦Нихана ¦рибозил трансфераза ¦ ¦
L--+----------------+-----------------------+----------------+----
-
Как следует данных Таблицы 9.2, на стадии клинических
испытаний в 1994г. уже находились 5 моногенных заболеваний.
Для 10 генных болезней проводились экспериментальные иссле-
дования и отрабатывались требования, необходимые для получе-
ния официального разрешения клинических испытаний (см.9.1).
Исследования по остальным заболеваниям находятся на началь-
ных этапах. Список таких заболеваний очень быстро увеличива-
ется. Обращает на себя внимание, что первые программы по
генной терапии связаны с модификацией гемопоэтических клеток
(Wivel, Walters, 1993). Клетки крови наиболее доступны для
генетических манипуляций. После изоляции различные типы кле-
ток крови могут быть легко размножены, подвергнуты трансфек-
ции in vitro, а затем возвращены пациенту. Генетической мо-
дификации могут быть подвергнуты не только зрелые клетки
(лимфоциты, макрофаги), но и их предшественники - стволовые
клетки. Важным обстоятельством, в этой связи, является то,
что процедура трансплантации клеток костного мозга уже широ-
ко используется в клинике. Разработаны и достаточно эффек-
тивные методы выделения стволовых гемопоэтических клеток че-
ловека (Berardi etal.,1995). В экспериментах на животных по-
казано, что модифицированные клетки как миелоидного, так и
лимфоидного рядов могут сохраняться в кровотоке на протяже-
нии более двух лет после аутологичной пересадки клеток кост-
ного мозга, трансдуцированных in vitro. Путем трансфекции
клеток крови соответствующими генами можно лечить не только
собственно заболевания крови, но и использовать их для лече-
ния многих других заболеваний как моногенной природы
(Табл. 9.2), так и различных опухолей и инфекций (см.ниже).
Другими достаточно универсальными реципиентами чужерод-
ных генов могут быть фибробласты и мышечные клетки (миоблас-
ты, миофибриллы). Они могут быть использованы для тех забо-
леваний, где необходима коррекция генов, белковые продукты
которых должны поступать в сыворотку крови или дифундировать
в соседние клетки. Особенно удобны для целей генной терапии
скелетные мышцы, в которых благодаря отсутствию эндонуклеаз-
ной активности (см.раздел 9.4.2) принципиально возможен пе-
ренос генов in vivo путем прямой иньекции экзогенной ДНК.
Инъецированная в мышцы ДНК способна экспрессироваться в мио-
фибриллах находясь в неинтегрированном, эксрахромосомном
состоянии. Белковые продукты экспрессии в течение длительно-
го времени после трансдукции будут поступать в кровь. Про-
должительность экспрессии значительно увеличивается, если
генетическую модификацию производят в аутологичных миоблас-
тах, которые после этого инъецируют в зрелую мышцу. Эти осо-
бенности уже позволили начать эксперименты по генной терапии
таких заболеваний как гемофилии А и В, дефицит антитрипсина,
диабет, врожденный дефицит гормона роста и даже болезнь Пар-
кинсона (Culver, 1994; Lowenstein, 1994). Достаточно удобны-
ми для генетических модификаций оказались и фибробласты ко-
жи, в первую очередь, благодаря легкости генноинженерных ма-
нипуляций ex vivo.
Раздел 9.6. Генотерапия ненаследственных заболеваний:
опухоли, инфекции.
Параллельно с развитием исследований в области генокор-
рекции наследственных дефектов успешными также оказались по-
иски методов терапевтического использования смысловых после-
довательностей ДНК для лечения ненаследственных заболеваний
и, главвным образом, злокачественных опухолей и вирусных ин-
фекций. Существенно, что именно в этих разделах патологии
поиски путей генокоррекции проводятся особенно интенсивно, а
число уже одобренных протоколов клинических испытаний во
много раз превышает число таковых для лечения моногенных бо-
лезней (см.Рис. 9.1). Такое положение дел, по-видимому,
прежде всего объясняется широкой распространенностью онколо-
гических заболеваний и отсутствием достаточно эффективной
терапии. В Табл. 9.3 перечислены основные методологические
подходы к генотерапии различных опухолей, разработанные и
широко используемые уже на современном этапе. Многие из этих
подходов вполне приложимы и для борьбы с наиболее серьезными
инфекционными заболеваниями, например, со спидом.
Таблица 9.3. Основные методологические подходы в генокоррек-
ции онкологических заболеваний.
---------------------------------T-----------------------------¬
¦ П Р И Н Ц И П ¦ ВВОДИМЫЕ ГЕНЫ ¦
+--------------------------------+-----------------------------+
¦1. Повышение иммунореактивности ¦ гены чужеродных ¦
¦ опухоли ¦ антигенов, цитокинов ¦
¦2. Генетическая модификация ¦ гены цитокинов, ¦
¦ иммунных клеток ¦ ко-стимуляторов ¦
¦3. Инсерция генов "чувствитель- ¦ гены тимидин-киназы HSV, ¦
¦ ности" либо генов "самоубийц"¦ цитозин дезаминазы ¦
¦4. Блок экспрессии онкогенов ¦ антисмысловые Ki-ras мРНК, ¦
¦ ¦ гены внутриклеточных антител¦
¦5. Инсерция генов-супрессоров ¦ р53 ¦
¦ опухолей ¦ ¦
¦6. Защита нормальных клеток от ¦ гены лекарственной ¦
¦ химеотерапии. ¦ устойчивости тип 1. ¦
¦7. Индукция синтеза противоопухо¦ гены интерлейкина-2, ¦
¦ левых в-в нормальными клеткам¦ интерферона ¦
¦8. Продукция противопухолевых ¦ вакцины типа БЦЖ, экспресси-¦
¦ рекомбинантных вакцин. ¦ рующей опухолевой антиген ¦
¦9. Локальная радиопротекция нор-¦ гены трансферазы, ¦
¦ мальных тканей с помощью ¦ глутатион синтетазы ¦
¦ антиоксидантов. ¦ ¦
L--------------------------------+------------------------------
Подробный анализ используемых при этом подходов и ре-
зультаты первых клинических испытаний выходит за рамки наше-
го изложения. Однако, материал этот настолько интересный и
многообещающий, что мы позволим себе на нескольких примерах
охарактеризовать основные принципы построения таких геноте-
рапевтических программ.
Как упоминалось ранее (см. 9.1), перенос гена в орга-
низм человека был осуществлен в 1989 году в большей степени
в исследовательских, а не в терапевтических целях. Это был
маркерный прокариотический ген neo, сообщающий клеткам ус-
тойчивость к неомицину. Он был введен пациенту, страдающему
злокачественной меланомой, в составе трансдуцированных
TIL-клеток (Т -лимфоцитов, полученных из опухолевых тканей
больного). В 1986г. вскоре после идентификации этого нового
класса иммунных клеток, была предпринята попытка лечения ме-
ланомы путем аутологичной внутривенной инфузии TIL-клеток,
предварительно выделенных из опухолей пациентов и интенсивно
наращиваемых in vitro в присутствии ростового фактора IL-2.
Примерно у трети пациентов лечение оказалось эффективным,
хотя в последующем наблюдали значительное число рецидивов
заболевания. Для анализа причин терапевтического эффекта TIL
-клеток и совершенствования методики лечения меланомы необ-
ходимо было исследовать устойчивость вводимых T-лимфоцитов и
их миграцию в организме больного. С этой целью была произве-
дена маркировка используемых для лечения TIL-клеток путем их
трансдукции в культуре ретровирусным вектором, несущим ген
neo, с последующим отбором неомицин-устойчивых клонов и вы-
ращиванием их на среде G418. Результаты исследований показа-
ли, что реинфузированные G418-устойчивые TIL-клетки действи-
тельно проникают в опухоль и могут быть обнаружены там в не-
большом количестве даже спустя 9 недель после введения. Най-
дены отличия субпопуляции T-лимфоцитов в опухоли от общей
популяции инфузированных TIL-клеток.
После успешного испытания переноса маркерного гена neo
в опухолевые ткани путем аутологичной реинфузии трансфециро-
ванных T-лимфоцитов лечение меланомы было дополнена введени-
ем в вектор мышиного гена, контролирующего продукцию, так
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73
