назад оценивалась в 1$.
В качестве модификаций метода Сэнджера используют пред-
варительное клонирование ДНК в векторах, сконструированных
на основе фага M13, для получения протяженных однонитевых
участков ДНК, которые могут быть непосредственно секвениро-
ваны без денатурации и праймирования. Очень эффективной ока-
залась система векторов mp8 и mp9, позволяющих вести сиквенс
одовременно в обоих направлениях и прочитывать участки боль-
шей протяженности. Интенсивно разрабатывается методология
автоматического ДНК секвенирования. Особенно перспективным
для массового секвенирования в автоматическом режиме оказа-
лось применение меченых различными флюорохромами дидеокси-
нуклеотидов. В этом варианте каждому из нуклеотидов соот-
ветствует свой цвет полосы в геле, который легко учитывается
автоматически. Этот метод нашел особенно широкое применение
в реализации программы Геном человека. По последним данным,
разработка автоматических секвенаторов позволила снизить
стоимость одного звена до 0,5$ и резко повысить эффектив-
ность этого процесса. Так, на 30 автоматических секвенаторах
фирмы Applied Biosystems за одну неделю работы в 1994г.мож-
но было просеквенировать до 1 млн пар оснований.
В последние годы активно разрабатываются принципиально
новые, более эффективные и экономичные методы секвенирова-
ния. Особенно перспективным на сегоднешний день представля-
ется метод секвенирования путем гибридизации исследуемой
последовательности ДНК с набором олигонуклеотидов, так назы-
ваемой олигонуклеотидной матрицей (Мирзабеков, 1990; Барский
и др.,1994; Southern, et al, 1992). Наиболее удобными для
этой цели являются наборы матриц - чипы, в ячейках которых
пришиты (иммобилизованы) октануклеотиды. Суть данного подхо-
да в том, что пришивается набор всех возможных вариантов пе-
рестановок из 4-х стандартных нуклеотидов (А,Г,Ц,Т) опре-
деленной длины, при этом в случае октануклеотидов количество
возможных вариантов нуклеотидов составляет 65536. Секвениру-
емый фрагмент ДНК метят радиоактивным фосфором и гибридизуют
с октануклеотидной матрицей. Фрагмент ДНК гибридизуется
только с теми октануклеотидами, последовательности которых
комплементарны его участкам. Таким образом, определяется на-
бор всех возможных октануклеотидов, присутствующих в иссле-
дуемом фрагменте ДНК. После этого, при помощи специальной
компьютерной обработки упорядочивается расположение этих ок-
тамеров в изучаемом фрагменте ДНК. Этот перспективный метод
позволяет значительно ускорить время секвенирования за счет
автоматизации процесса.
1.7 Полимеразная цепная реакция.
До недавнего времени гибридизация с ДНК-зондами и клони-
рование являлись единственными способами поиска и выделения
специфических геномных или к-ДНК-овых последовательностей
ДНК с целью их дальнейшего исследования. Не говоря уже о
большой трудоемкости этих методов, они имеют ряд принципи-
альных недостатков и ограничений. Во-первых, исследуемые
фрагменты значительно превосходят по длине ДНК-зонды и слиш-
ком велики для прямого молекулярного анализа. Концы этих
последовательностей не могут быть выбраны произвольно, так
как определяются наличием соответствующих рестрикционных
сайтов в исследуеммой молекуле ДНК. Во-вторых, для проведе-
ния успешной рестрикции и гибридизации необходимо большое
количество хорошо очищенной высокомолекулярной геномной ДНК
(не менее 10 микроГ на одну реакцию). Такое количество ДНК
обычно получают из 3- 5 мл крови. Часто это количество ока-
зывается слишком большим, если учесть, что речь идет о детях
и о тяжело больных людях. Кроме того, необходимость немед-
ленного использования собранной крови для выделения ДНК или
хранения ее до использования при -20 С затрудняет исследова-
ние нетранспортабильных пациентов или родственников, прожи-
вающих на отдаленном расстоянии от исследовательских цент-
ров. В-третьих, для геномной гибридизации, как правило, не-
обходимы радиоактивные ДНК-зонды с высокой удельной актив-
ностью, не менее 10!8-10!9 имп./мин/мкГ., причем они должны
быть использованы в течение очень короткого периода после их
приготовления. Кроме того, работа с радиоактивным материалом
требует соблюдения необходимой техники безопасности и нали-
чия специально оборудованного изотопного блока, что возможно
лишь для некоторых диагностических центров. В-четвертых, не-
обходимость длительной экспозиции автографов значительно уд-
линяет время получения результатов, что также ограничивает
использование методов блот-гибридизации для пренатальной ди-
агностики плода, специфика которой во многом определяется
сроком беременности.
Предложенный в 1983г. американским исследователем
Карри Муллисом, удостоенным за это изобретение Нобелевской
премии в 1993г., альтернативный метод анализа геномной ДНК -
метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), явился эпохальным
открытием молекулярной биологии нашего века. Метод ПЦР или
специфической амплификации ДНК позволяет избирательно синте-
зировать in vitro относительно небольшие участки ДНК, длиной
от нескольких десятков до нескольких сотен пар нуклеотидов,
реже до 1000 - 2000 п.о., используя в качестве матрицы любые
образцы ДНК, содержащие амплифицируемую последовательность.
Необходимым условием для проведения ПЦР является знание нук-
леотидной последовательности амплифицируемой области ДНК,
так как специфический выбор этого участка осуществляют путем
гибридизации матричной ДНК с двумя искусственно синтезиро-
ванными праймерами - олигонуклеотдными последовательностями
ДНК, длиной, обычно, от 15 до 30 п.о., комплементарными 3'-
концам амплифицируемого участка на смысловой и антисмысловой
нитях ДНК, соответственно. Таким образом, расстояние между
праймерами определяяет длину синтезируемых молекул. В ка-
честве матрицы для синтеза может быть использован любой тип
ДНК - геномная ДНК отдельных индивидуумов различных видов
про- и эукариот; ДНК, выделенная из культур клеток, бактери-
альных клонов, библиотек генов или из других источников. Для
проведения специфической амплификации не требуется больших
количеств матричной ДНК и, в принципе, достаточно даже одной
молекулы ( Li et al., 1988). Успех в разработке метода ПЦР в
значительной мере связан с использованием в качестве фермен-
та, обеспечивающего синтез ДНК, термофильной ДНК полимеразы,
выделенной из бактерий, живущих в горячих источниках, и по-
тому устойчивой к действию высоких температур (Kogan et al.,
1987).
Принципиальная схема полимеразной цепной реакции пока-
зана на Рис.1.10. На первом этапе исследуемая двухнитевая
матричная ДНК переводится в однонитевую форму путем ее наг-
ревания в течение нескольких минут до температуры, превышаю-
щей +95 - +98 С. Дальнейшая схема проведения ПЦР достаточно
проста и заключается в чередовании циклов (1) гибридизации
или отжига ДНК с праймерами, (2) синтеза последовательности,
комплементарной матричной ДНК, и (3) денатурации образовав-
шихся двухнитевых структур. При гибридизации, достигаемой за
счет понижения температуры реакционной смеси до +30 - + 50
С, происходит образование двухнитевого участка ДНК в строго
специфичных областях, комплементарных праймерам. При темпе-
ратуре, оптимальной для работы ДНК-полимеразы - +60 - +70 С,
начинается синтез ДНК в направлении 5' - 3' с двухнитевого
участка, образованного праймерами. Затем при нагревании
раствора примерно до +80 - +90 С синтез прекращается и двух-
нитевой участок между матричными и вновь синтезированными
молекулами ДНК расплавляется (денатурирует). В первом цикле
олигопраймеры гибридизуются с исходной матричной ДНК, а за-
тем в последующих циклах и с вновь синтезированными молеку-
лами ДНК по мере их накопления в растворе. В последнем слу-
чае синтез ДНК заканчивается не при изменении температурного
режима, а по достижении ДНК-полимеразой границы амплифициро-
ванного участка, что и определяет, в кончном счете, размер
вновь синтезированного участка ДНК с точностью до одного
нуклеотида.
Таким образом, при каждом цикле происходит двухкрат-
ное увеличение числа синтезированных копий выбранного для
амплификации участка ДНК и содержание продуктов амплификации
в растворе нарастает в геометрической прогрессии. Каждая из
процедур цикла определяется двумя параметрами - температурой
реакции и ее длительностью, меняющейся в диапозоне от десят-
ков секунд до 1 - 3 минут, так что полный цикл длится
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73
