ляются автономно реплицирующиеся циркулярные микрохромосомы
раковых клеток (Hodgson, 1995).
Особенно привлекательной в плане генной коррекции
представляется возможность замены всего мутантного гена или
его мутировавшей части (например, одного экзона) на нормаль-
ный аналог, что может быть достигнуто путем гомологичной ре-
комбинации. При этом в идеале можно ожидать не только дли-
тельную персистенцию введенного гена, но и сохранение нор-
мальной экспрессии. С этой целью в конструкции, используемые
для переноса ДНК, включают агенты, повышающие частоту гомо-
логичного спаривания, например, бактериальную рекомбина-
зу. Показано, что в этих условиях частота гомологичной ре-
комбинации может превышать 2.5*10-4. Это достаточно для то-
го, чтобы с помощью ПЦР отобрать нужные клоны клеток. Для
направленного введения фрагментов гена в строго определенные
локусы генома недавно разработана система двойной замены,
основанная на использовании HPRT-зависимых эмбриональных
стволовых клеток и векторной конструкции содержащей ген HPRT
(гипоксантин-фосфорибзилтрансферазы) и ген тимидин-киназы
вируса герпеса (HSV). Двойная селекция трансформантов позво-
ляет отобрать клетки, в которых произошла гомологичная ре-
комбинация. Такой подход нашел широкое применение при созда-
нии искусственных моделей наследственных болезней у человека
(см. подробней Главу VIII). Однако, в клинической практике
он еще не используется.
Раздел 9.5 Генотерапия моногенных наследственных забо-
леваний.
Вопросы генотерапии наследственных заболеваний подробно
рассмотрены в многочисленных обзорах (Ledley, 1987; Ander-
son, 1992; Pyeritz, 1993; Breakefield, 1993; Lowenstein,
1994; Kay, Woo, 1994; Brown et al., 1994; Дризе, 1994; Crys-
tal, 1995) и достаточно полно суммированы в недавно опубли-
кованной монографии (Culver, 1994).
Уже через год после первого введения маркерного гена в
организм человека была проведена успешная клеточная сомати-
ческая генотерапия наследственного заболевания, обусловлен-
ного дефицитом аденозиндезаминазы (ADA) (см. 9.1). При этом
заболевании в крови пациентов накапливается в высокой кон-
центрации 2'-дезоксиаденозин, оказывающий токсическое дейс-
твие на T- и B- лимфоциты, в результате чего у больных раз-
вивается серьезный комбинированный иммунодефицит. Для под-
держания жизни пациентов проводят переодические гетерологич-
ные трансплантации клеток костного мозга, однако, лишь для
трети больных могут быть подобраны совместимые доноры. Эн-
зим-замещающая терапия также приводит к заметному улучшению
состояния пациентов, но, как правило, успех этот носит вре-
менный характер. План генной терапии, разработанный сотруд-
никами Национального Института Здоровья США (NIH) и одобрен-
ный RAC, заключался в назначении больным аутологичных лимфо-
цитов, трансдуцированных нормальным ADA-геном. Осуществление
этого плана потребовало выполнения следующих процедур: изо-
ляции клеток из крови пациента; активации и иммуностимуляции
роста T-лимфоцитов в культуре; трансдукции их ретровирусным
вектором, несущим нормальный ADA-ген и маркерный ген neo;
отбора трансдуцированных клеток на селективной среде; внут-
ривенной реинфузии модифицированных T-лимфоцитов пациенту.
Первой пациенткой, подвергшейся этой терапии, была 4-х лет-
няя девочка (см.раздел 9.1). На протяжении 10.5 месяцев ей
было сделано 8 аутологичных вливаний трансдуцированных
T-лимфоцитов и после полугодового перерыва программу реинфу-
зий повторяли каждые 3-5 месяцев. Уже после первого цикла
число T-лимфоцитов нормализовалось, концентрация ADA в цир-
кулирующих клетках крови увеличилась с 1% до 20 - 25% нор-
мального уровня и резко улучшились основные иммунные харак-
теристики. Вопреки многим прогнозам, на протяжении более,
чем 6 месяцев после прекращения массированных вливаний в
кроветоке пациентки устойчиво сохранялось высокое число кор-
ректированных T-клеток, что позволило в дальнейшем снизить
количество вводимых клеток и значительно увеличить промежут-
ки между этими процедурами. Спустя три месяца после первых
клинических испытаний была начата программа генной терапии
ADA-дефицита у второй 9-летней пациентки. После 11 инфузий
трансдуцированных аутологичных T-клеток состояние этой де-
вочки также заметно улучшилось и отмечалась полная нормали-
зация соответствующих биохимических и иммунологических пока-
зателей. Таким образом, необходимо еще раз отметить, что при
лечении обеих пациенток был достигнут очевидный клинический
эффект (Anderson,1992; Culver, 1994).
Однако, в обоих случаях не все иммунные функции восста-
навливались полностью. По-видимому, это было связано с тем,
что коррекция генетического дефекта проводилась в зрелых
T-лимфоцитах. В связи с этим предложены программы генной те-
рапии с помощью реинфузии смешанной популяции трансдуциро-
ванных T-лимфоцитов и перефирических стволовых клеток крови.
Возможность изоляции и трансдукции таких тотипатентных ство-
ловых клеток показана в экспериментах на приматах.
Успех первых клинических испытаний явился мощным стиму-
лом для ускорения развития новых генотерапевтических методов
применительно к другим наследственным заболеваниям. В
Табл. 92 представлен список болезней, для которых принципи-
ально возможен генотерапевтический подход и генокоррекция
наследственного дефекта с большой вероятностью будет осу-
ществлена уже в обозримом будущем, а также те заболевания,
для которых уже имеются официальныо утвержденные протоколы и
которые находятся на разных стадиях клинических испытаний.
Таблица 9.2. Наследственные заболевания, генокоррекция кото-
рых находится на стадии клинических испытаний (КИ), экспери-
ментальных разработок (ЭР) и принципиально возможна (ПВ).
(Сulver, 1994; Lowenstein, 1994)
---T----------------T-----------------------T----------------T----
¬
¦ ¦Болезнь ¦ Дефектный ген ¦ Клетки-мишени ¦Ста-
¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦дия
+--+----------------+-----------------------+----------------+----
+
¦1 ¦Иммунодефицит ¦аденозиндезаминаза ¦лимфоциты ¦ КИ
¦2 ¦Иммунодефицит ¦пуриннуклеозид- ¦лимфоциты ¦ ПВ
¦ ¦ ¦фосфорилаза ¦ ¦
¦3 ¦Семейная гипер- ¦рецептор липопротеинов ¦гепатоциты ¦ КИ
¦ ¦холистеринемия ¦низкой плотности ¦ ¦
¦4 ¦Гемофилия В ¦фактор 1Х ¦фибробласты ¦ КИ
¦5 ¦Гемофилия А ¦фактор Y111 ¦миобласты, ¦ ЭР
¦ ¦ ¦ ¦фибробласты ¦
¦6 ¦Болезнь Гоше ¦в-глюкоцереброзидаза ¦макрофаги, ¦ КИ
¦ ¦(сфинголипидоз) ¦ ¦стволовые клетки¦
¦7 ¦Болезнь Хантера ¦идуронат-сульфатаза ¦макрофаги, ¦ ПВ
¦ ¦ ¦ ¦стволовые клетки¦
¦8 ¦Синдром Гурлера ¦L-идуронидаза ¦макрофаги, ¦ ПВ
¦9 ¦Эмфизема легких ¦альфа-1-антитрипсин ¦лимфоциты ¦ ЭР
¦10¦Муковисцидоз ¦CF-трансмембранный ¦эпителий бронхов¦ КИ
¦ ¦ ¦регулятор ¦ ¦
¦11¦Фенилкетонурия ¦фенилаланингидроксилаза¦гепатоциты ¦ ЭР
¦12¦Гипераммонемия ¦орнитинтранскарбамилаза¦гепатоциты ¦ ПВ
¦13¦Цитрулинемия ¦аргиносукцинатсинтетаза¦гепатоциты ¦ ПВ
¦14¦Мышечная дист- ¦дистрофин ¦миобласты, ¦ ЭР
¦ ¦рофия Дюшенна ¦ ¦миофибриллы ¦
¦15¦Талассемия ¦бета-глобин ¦эритробласты ¦ ЭР
¦16¦Серповиднокле- ¦бета-глобин ¦эритробласты ¦ ЭР
¦ ¦точная анемия ¦ ¦ ¦
¦17¦Респираторный ¦сурфактант ¦эпителий бронхов¦ ЭР
¦ ¦дистресс-синдром¦белок В ¦ ¦
¦18¦Хронический ¦NADPH-оксидаза ¦гранулоциты ¦ ЭР
¦ ¦грануломатоз ¦ ¦ ¦
¦19¦Болезнь ¦белок-предшественник ¦нервные клетки ¦ ЭР
¦ ¦Альцгеймера ¦в-амилоида (ААР) ¦ ¦
¦20¦Болезнь ¦тирозин-гидроксилаза ¦миобласты, ¦ ЭР
¦ ¦Паркинсона ¦ ¦фибробласты ¦
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73
