ленного изменения генных дефектов, либо придания клеткам но-
вых функций (Culver, 1994). Первые клинические испытания ме-
тодов генной терапии были предприняты 22 мая 1989г. с целью
генетического маркирования опухоль-инфильтрующих лимфоцитов
в случае прогрессирующей меланомы. Маркированные прокариоти-
ческим геном neo, Т-лимфоциты были устойчивы к неомицину и
могли быть легко отселектированы в культуре, что позволило
детально проследить их судьбу в кровотоке и избирательное
накопление в опухолях (подробней см. 9.5).
Первым моногенным наследственным заболеванием, в отно-
шении которого были применены методы генной терапии, оказал-
ся наследственный иммуннодефицит, обусловленный мутацией в
гене аденозин-дезаминазы. 14 сентября 1990г.в Бетезде (США)
4-х летней девочке, страдающей этим достаточно редким забо-
леванием (1 : 100 000), были пересажены ее собственные лим-
фоциты, предварительно трансформированные ex vivo геном ADA
(ген ADA + ген neo + ретровирусный вектор). Лечебный эффект
наблюдался в течение нескольких месяцев, после чего процеду-
ра была повторена с интервалом 3-5 месяцев (Anderson, 1992;
Culver, 1994). В течение 3-х лет терапии в общей сложности
проведено 23 внутривенных трансфузии ADA-трансформированных
Т-лифоцитов без видимых неблагоприятных эффектов. В резуль-
тате лечения состояние пациентки (Ашанти В. ДеСильва) нас-
только улучшилось, что она смогла вести нормальный образ
жизни и не бояться случайных инфекций. Столь же успешным
оказалось и лечение второй пациентки с этим заболеванием
(подробней см. раздел 9.5). В настоящее время клинические
испытания генной терапии этого заболевания проводятся в Ита-
лии, Франции, Великобритании и Японии.
Другие моногенные наследственные заболевания, в отноше-
нии которых уже имеются официально разрешенные протоколы и
начаты клинические испытания, касаются семейной гиперхолес-
теринемии (1992); муковисцидоза (1993); гемофилии В (1992);
болезни Гоше (1993). В отношении многих других заболеваний
медицинские протоколы клинических испытаний находятся в ста-
дии утверждения (см. раздел 9.5.). К 1993г. только в США к
клиническим испытаниям генно-инженерных конструкций на чело-
веке было допущено 53 проекта (Culver, 1994). К 1995г. в ми-
ре число таких проектов возросло до 100 и более 400 пациен-
тов было непосредственно вовлечено в эти исследования (Hodg-
son, 1995). Подавляющее большинство таких проектов (86) ка-
салось лечения онкологических заболеваний, а также спида.
Таким образом, от опытов на животных и теоретических
построений 80-х годов уже в 1990 году удалось приступить к
реальному лечению моногенных заболеваний, число которых
стремительно нарастает. Естественно, что подобные революци-
онные перемены могли возникнуть только в результате решающих
успехов молекулярной биологии в картировании генов, мутации
которых приводят к наследственным заболеваниям (см.Главу
III), выяснении молекулярной природы этих мутаций (см.Главу
IV), успехов в секвенировании и клонировании генов (см.Главы
I и II), создании генно-инженерных конструкций (см.Главу
II), отработки и совершенствования методов их доставки
(см.ниже). Следует также подчеркнуть, что качественный ска-
чок в области генной терапии, когда сам ген стал рассматри-
ваться как лекарственный препарат, стал возможен благодаря
тому, что предшествующие экспериментальные и клинические
исследования доказали безопасность генной терапии.
Вместе с тем, и в сегодняшних исследованиях по генной
терапии необходимо учитывать, что последствия манипулирова-
ния генами или рекомбинантными ДНК in vivo изучены недоста-
точно. Следует помнить, что введение в организм человека
последовательностей ДНК, не находящихся под контролем свойс-
твенных им регуляторных элементов, может приводить к трудно
предсказуемым измененим метаболических процессов и сопровож-
даться функциональным дисбалансом. Современные представления
о структуре генома и его взаимодействиях с экзогенными ДНК и
вирусными последовательностями, часто используемыми в ка-
честве векторов для переноса генов (см. 9.2), могут оказать-
ся недостаточными для прогнозирования возможных нежелатель-
ных или неконтролируемых последствий такого вмешательства.
Поэтому при разработке программ генной терапии принципиаль-
ное значение имеют вопросы безопасности предлагаемых схем
лечения как для самого пациента, так и для популяции в целом
(Anderson, 1992; Miller, 1992). Важно, чтобы при проведении
испытаний ожидаемый лечебный эффект или возможность получе-
ния дополнительной полезной информации превосходили потенци-
альный риск предлагаемой процедуры. Неслучайно, в странах с
наиболее продвинутым уровнем исследований в этой области,
особенно в США, медицинские протоколы с использованием смыс-
ловых последовательностей ДНК подвергаются обязательной экс-
пертизе в соответствующих комитетах и комиссиях. Клинические
испытания предложенной генотерапевтической процедуры возмож-
ны только после ее одобрения соответствующим законодательно
утвержденным органом. В США таковыми являются: Консультатив-
ный Комитет по Рекомбинантным ДНК (Recombinant DNA Advisory
Committee - RAC), Комитет по лекарствам и пищевым продуктам
(Food and Drug Administration -FDA), с последующим обяза-
тельным утверждением проекта директором Национального Инсти-
тута Здоровья (National Institute of Health) (Miller, 1992;
Anderson, 1992; Culver, 1994). В Европе такие протоколы сос-
тавляются и утверждаются в соответствии с рекомендациями Ев-
ропейской Рабочей Группы по Переносу Генов и Генной Терапии
(European Working Group on Human Gene Transfer and Therapy)
(Cohen-Haguenauer, 1995). Программы генной терапии для кли-
нических испытаний должны включать следующие разделы: обос-
нование выбора нозологии для проведения курса генной тера-
пии; определение типа клеток, подлежащих генетической моди-
фикации; схему конструирования экзогенной ДНК; обоснование
биологической безопасности вводимой генной конструкции,
включающая опыты на культурах клеток и на модельных (транс-
генных) животных; разработку процедуры ее переноса в клетки
пациента; методы анализа экспрессии введенных генов; оценку
клинического (терапевтического) эффекта; возможные побочные
последствия и способы их предупреждения (Culver, 1993; Co-
hen-Haguenauer, 1995).
Важнейшим элементом в программе генной терапии является
анализ последствий проводимых процедур. Этот контроль прово-
дят на всех этапах терапии, причем исследования выполняют на
различных уровнях. Прежде всего, после переноса гена осу-
ществляют поиск модифицированных клеток в организме пациента
и следят за динамикой этих клеток в определенных тканях.
Этот поиск может быть облегчен при наличии маркерного гена в
конструкции. Присутствие последовательностей экзогенной ДНК
в модифицированных клетках чаще всего идентифицируют с по-
мощью ПЦР. На следующем этапе производят анализ экспрессии
введенных генов путем идентификации и количественной оценки
соответствующего РНК-транскрипта, либо белкового продукта
гена. В тех случаях, когда это возможно, проводят анализ
коррекции первичного биохимического дефекта. Затем, все по-
лученные данные сопоставляют с результатами комплексного ме-
дицинского обследования и вносят необходимые исправления и
добавления в проводимую схему лечения.
Раздел 9.2. Типы генотерапевтических вмешательств, вы-
бор клеток-мишеней.
Рассмотрим наиболее общие принципы, лежащие в основе
построения программ генной терапии. Итак, генная терапия
предполагает введение последовательностей ДНК в клетки-мише-
ни. Она проводится либо с целью коррекции наследственной па-
тологии, возникшей вследствие генетического дефекта, либо
для придания этим клеткам новых функций, способствующих уст-
ранению патологических процессов. В первом случае, в орга-
низм больного вводят нормально работающий гомолог дефектного
гена. Второй подход применяют при лечении, таких заболева-
ний, как опухоли или инфекции. В этих случаях вводят гены,
обладающие условным цитотоксическим эффектом или способству-
ющие формированию выраженного иммунного ответа. Мишенями для
таких генов служат пораженные ткани, иммунные клетки, специ-
фическим образом проникающие в эти ткани, либо предваритель-
но трансформированные in vitro другие клетки. Таким образом,
в зависимости от характера заболевания и предполагаемого ге-
нотерапевтического подхода объектом генетической трансфекции
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73
