приближения к рибонуклеопротеидному комплексу той тРНК, у
которой последовательность нуклеотидов в антикодоне компле-
ментарна кодирующему триплету мРНК. Таким образом транспор-
тируется соответствующая аминокислота и осуществляется пос-
ледовательный синтез полипептидной цепи. Митохондрии имеют
свою автономную систему белкового синтеза: рибосомальные
РНК, мРНК и транспортные РНК.
Генетический код универсален для всех живых существ -
это одно из его главных свойств. Небольшие отличия в струк-
туре кода найдены только для митохондриальной ДНК. Так в ми-
тохондриальном генетическом коде стоп кодонами являются
триплеты АГА и АГЦ, кодирующие аргинин в ядерной ДНК
(Табл.1.1). Универсальность генетического кода служит наибо-
лее веским аргументом в пользу гипотезы об едином источнике
возникновения жизни на земле и о филогенетическом родстве
всех видов живых существ. Кроме того, именно это свойство
обеспечивает возможность прочтения в любых модельных клеточ-
ных системах искусственно введенной генетической информации,
сконструированной из фрагментов ДНК разного видового про-
исхожденеия. Таким образом, вся генная инженерия основана на
универсальности генетического кода. Другим свойством генети-
ческого кода является его вырожденность, заключающаяся в
том, что все аминокислоты кроме двух кодируются несколькими
вариантами триплетов. Действительно, из 64 возможных комби-
наций нуклеотидных триплетов РНК три соответствуют термини-
рующим кодонам - ochre, amber и opal, остальные варианты
(61) кодируют 20 аминокислот, причем триплеты, кодирующие
одну и ту же аминокислоту, как правило, различаются по
третьему нуклеотиду в кодоне. Таким образом, зная нуклеотид-
ную последовательность кодирующего участка ДНК, можно одноз-
начно прогнозировать аминокислотную последовательность соот-
ветствующего полипептидного фрагмента, тогда как одна и та
же аминокислотная последовательность может кодироваться раз-
личным образом. При этом, число возможных вариантов кодирую-
щих ДНК резко возрастает с увеличением длины полипептида.
На следующем этапе полипептидные цепи транспортируются
к специфическим органеллам клетки и модифицируются с образо-
ванием зрелого функционально активного белка. В некоторых
случаях информация с молекул РНК может обратно транскрибиро-
ваться в молекулы ДНК. В частности, при обратной транскрип-
ции мРНК образуются молекулы комплементарной ДНК - кДНК, в
которой в зависимости от полноты процесса представлены
частично или полностью все смысловые кодирующие последова-
тельности гена. Рассмотренная схема реализации однонаправ-
ленного потока информации ДНК-РНК-Белок составляет основу
центральной молекулярно-биологической догмы - рис.1.1.
Более детально с процессами репликации, транскрипции,
процессинга и трансляции можно ознакомиться в многочисленных
руководствах по молекулярной биологии, цитологии и генетике
(Стент, Кэлиндер, 1981; Зенгер, 1987; Льюин, 1987).
1.2 Выделение ДНК, ее синтез и рестрикция.
ДНК может быть изолирована из любого типа тканей и кле-
ток, содержащих ядра. Этапы выделения ДНК включают быстрый
лизис клеток, удаление с помощью центрифугирования фрагмен-
тов клеточных органелл и мембран, ферментативное разрушение
белков и их экстрагирование из раствора с помощью фенола и
хлороформа, концентрирование молекул ДНК путем преципитации
в этаноле. Из 1 грамма сырой ткани или из 10!9 клеток обычно
получают 2 миллиграмма ДНК. У человека ДНК, чаще всего, вы-
деляют из лейкоцитов крови, для чего собирают от 5 до 20 мл
венозной крови в стерильную пробирку с раствором, пре-
пятствующим коагуляции (например, с глюгециром или гепари-
ном). Затем отделяют лейкоциты и разрушают клеточные и ядер-
ные мембраны добавлением буферных растворов, содержащих де-
натурирующие агенты. Наилучшие результаты при выделении ДНК
дает применение протеиназы-К с последующей фенол - хлоро-
формной экстракцией разрушенных белков. ДНК осаждают в эта-
ноле и растворяют в буферном растворе. Оценку качества экс-
трагированной ДНК проводят на основании измерения оптической
плотности раствора ДНК в области белкового и нуклеинового
спектров поглощения. В чистых образцах ДНК соотношение
А(260)/A(280) > 1.8. В противном случае процедуру очистки
необходимо повторять, так как для успешного использования и
хранения ДНK белки должны быть полностью удалены. Более под-
робно с методами выделения и очистки ДНК из различных тканей
можно ознакомиться в работах и руководствах, приведенных в
конце книги (Маниатис и др., 1984; Дейвис, 1990; Горбунова и
др., 1991).
В процессе сложного и многообразного функционирования
различные участки хромосом и ДНК претерпевают разнообразные
регулируемые и, в основе своей, обратимые изменения. Эти мо-
дификации осуществляются с помощью специальных белков - фер-
ментов. Описание ферментативного аппарата репликации, транс-
крипции, репарации - системы защиты и восстановления повреж-
денных участков ДНК, рекомбинации, то есть обмена участками
гомологичных хромосом и ДНК, далеко выходит за рамки нашего
изложения. Мы кратко ознакомимся только с двумя классами
ферментов ДНК - полимеразами и рестриктазами, особенно важ-
ными для понимания основ современной молекулярной диагности-
ки.
Ферменты, осуществляющие синтез ДНК, называются ДНК-по-
лимеразами. И в бактериальных клетках, и в клетках эукариот
содержатся три различные формы ДНК-полимераз, все они обла-
дают синтезирующей активностью и способны удлинять цепи ДНК
в направлении 5' - 3', последовательно наращивая по одному
нуклеотиду к 3'-OH концу, причем точность синтеза определя-
ется специфичностью спаривания оснований. Таким образом, для
работы ДНК-полимеразы необходима однонитевая матричная ДНК с
двухнитевым участком на 3'- конце молекулы. Кроме того, в
среде должны присутствовать четыре типа трифосфатов (dATP,
dCTP, dGTP и dTTP) - молекул, состоящих из основания -A,C,G
или T, сахара - дезоксирибозы (d) и трех фосфатных остатков
(P). В клетках эукариот репликацию осуществляет ДНК-полиме-
раза альфа, а в клетках E. coli - ДНК-полимераза 111.
ДНК-полимеразы обладают различными активностями, в том числе
и экзонуклеазной в направлении 3' - 5', что позволяет им
исправлять - репарировать, дефекты, допущенные при подборе
комплементарных оснований. ДНК-полимераза 1 E. coli способна
инициировать репликацию в месте разрыва ДНК и замещать гомо-
логичный участок в двойной цепи ДНК. Это свойство использу-
ется для введения в ДНК меченых нуклеотидов методом
ник-трансляции.
Открытие бактериальных ферментов, обладающих эндонукле-
азной активностью - рестрикционных эндонуклеаз или рестрик-
таз, значительно продвинуло исследование структуры ДНК и
возможности генноинженерного манипулирования с молекулами
ДНК. In vivo эти ферменты участвуют в системе распознования
и защиты "своих" и уничтожении чужеродных ДНК. Рестриктазы
узнают специфические последовательности из 4 - 6, реже 8 -
12 нуклеотидов в двухцепочечной молекуле ДНК и разрезают ее
на фрагменты в местах локализации этих последовательностей,
называемых сайтами рестрикции. Количество образующихся рест-
рикционных фрагментов ДНК определяется частотой встречаемос-
ти сайтов рестрикции, а их размер - характером распределения
этих сайтов по длине исходной молекулы ДНК. Чем чаще распо-
ложены сайты рестрикции, тем короче фрагменты ДНК после
рестрикции. В настоящее время известно более 500 различных
типов рестриктаз бактериального происхождения, причем каждый
из этих ферметов узнает свою специфическую последователь-
ность. Рестриктазы выделяют путем биохимической очистки из
различных видов бактерий и обозначают тремя буквами, соот-
ветствующими первым трем буквам латинского названия вида
бактерий, и римской цифрой, соответствующей хронологии отк-
рытия этого фермента у данного вида бактерий. В зависимости
от частоты встречаемости сайтов рестрикции в молекуле ДНК
различают три класса рестриктаз часто-, средне- и редкощепя-
щие. Естественно, что рестриктазы, узнающие длинные специфи-
ческие последовательности (8-12 п.о.), как правило, являются
редкощепящими (например Nor1), а узнающие короткие (4-5
п.о.) - частощепящими (Taq1, EcoR1).
Сайты рестрикции могут быть использованы в качестве
генетических маркеров ДНК. Действительно, образующиеся в ре-
зультатае рестрикции фрагменты ДНК могут быть упорядочены по
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73
