¦ Химические: ¦ ¦ ¦ ¦
¦ Са-фосфат ¦ ¦ ¦ ¦
¦ преципитация ¦ низкая ¦ низкая ¦трнзиторная ¦
+-------------------+------------+-------------+------------+
¦ Физические: ¦ ¦ ¦ ¦
¦ Электропорация ¦ низкая ¦ низкая ¦транзиторная¦
¦ Микроинъекция ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦
¦ "Бомбардировка" ¦ ¦ ¦ ¦
¦ частицами золота ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦
¦Слияние: ¦ ¦ ¦ ¦
¦Липосомы ¦ низкая ¦ низкая ¦транзиторная¦
¦Рецептор-опосредо- ¦ ¦ ¦ ¦
¦ванный эндоцитоз: ¦ ¦ ¦ ¦
¦ДНК-белковый ¦ ¦ ¦ ¦
¦комплекс ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦
¦ДНК-комплекс- ¦ ¦ ¦ ¦
¦вирусная капсида ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦
¦Рекомбинантные ¦ ¦ ¦ ¦
¦вирусы: ¦ ¦ ¦ ¦
¦Аденовирус ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦
¦Адено-ассоцииро- ¦ ¦ ¦ ¦
¦ванный вирус (AAV) ¦ высокая ¦ низкая ¦длительная ?¦
¦Вирус герпеса (HSV)¦ низкая ¦ низкая ¦слабая ¦
¦Вирус иммуно- ¦ ¦ ¦ ¦
¦дефицита (HIV) ¦ высокая ¦ высокая ¦длительная ?¦
¦Вирус мышиной лейке¦ ¦ ¦ ¦
¦мии Молони (MoMLV) ¦ высокая ¦ высокая ¦длительная ?¦
¦Вирус ветряной ¦ ¦ ¦ ¦
¦оспы (Vaccinia) ¦ высокая ¦ низкая ¦слабая ¦
L-------------------+------------+-------------+-------------
Как следует из представленных данных, введение чужерод-
ных генов in vitro может быть весьма эффективно как при по-
мощи некоторых физических способов доставки (электропоации,
бомбардировки частицами золота), так и, практически, при
всех вариантах биологической доставки, особенно, с помощью
рекомбинантных вирусов. Однако, реально интеграция в геном
клетки-реципиента может быть достигнута только в случае рет-
ровирусных или адено-ассоциированных векторов, обладающих
необходимыми для встраивания в эукариотическую ДНК свойства-
ми. При этом отсутствие встраивания в геномную ДНК, как пра-
вило, коррелирует с транзиторной (временной) экспрессией ге-
на. Следовательно, только вирусные векторы или генетические
конструкции, включающие вирусные последовательности способны
к активной трансфекции, а в ряде случаев и к длительной экс-
прессии чужеродных генов. Следует напомнить в этой связи,
что из 100 уже одобренных проектов генотерапии 95 предпола-
гают использовать вирусную трансдукцию и 86 из них основаны
на применении ретровирусных векторов.
Несмотря на усилия многих генно-инженерных лабораторий,
Центров, а в последнее время и фармацевтических фирм, от-
сутствие идеальных векторов, обладающих эффективной (100%)
трансфекцией как ex vivo так и in vivo, в сочетании с высо-
кой пакующей способностью (включение генетической конструк-
ции от 1 до 1 000 тысяч п.о.), интегрирующих в геном или не-
интегрирующих, но обеспечивающих длительную и, что особенно
важно, регулируемую экспрессию, при отсутствии опасности он-
когенных модификаций или иных нежелательных побочных эффек-
тов, продолжает оставаться одним из серьезных препятствий на
пути внедерения генотерапии (Hodgson, 1995).
Раздел 9.4. Конструирование векторных систем и совер-
шенствование методов трансформации клеток
человека.
9.4.1. Основные векторные системы.
В Табл.9.1 приведены основные типы векторных систем.
Остановимся подробнее на способах их конструирования, преи-
муществах и недостатках, некоторые из которых уже упомина-
лись в предыдущем разделе. Как правило, вводимая генетичес-
кая конструкция представляет собой полноразмерную кДНК-овую
последовательность определенного гена, инсертированную в
экспрессионный вектор, то есть находящуюся под действием
сильного промотора. Выбор подходящего промотора зависит от
многих параметров, главным из которых является необходимый
уровень экспрессии гена в клетках-мишенях. Вектор часто со-
держит один из маркерных генов, таких как гены neo, бе-
та-Gal, ген люциферазы и др., присутствие которых в трансду-
цированных клетках может быть легко обнаружено по наличию
либо соответствующего белкового продукта (гистохимически для
генов бета-Gal и люциферазы), либо маркерных последователь-
ностей ДНК. Если в качестве маркера выбран селектируемый ген
(neo), отбор клеток, трансфецированных in vitro, может про-
изводиться автоматически на соответвтвующих селективных сре-
дах. Существует два типа конструкций; один - на основе плаз-
мидной ДНК, другой - на базе вирусов. Плазмидные конструкции
удобны для клонирования, генно-инженерных манипуляций и по-
лучения большого количества рекомбинантной ДНК. Однако, бак-
териальные плазмиды, в отличие от вирусных конструкций, не
способны самостоятельно проникать в эукариотические клетки.
Для введения инсертированной в плазмиду экзогенной ДНК в
клетки человека необходимо перенести ее в подходящий вирус-
ный вектор или применить способ, облегчающий ее прохождение
через клеточные мембраны.
9.4.2 Методы физического переноса чужеродной ДНК в
клетки эукариот.
Уместно заметить, что чужеродная ДНК может спонтанно
проникать в клетки эукариот, благодаря наличию на наружных
клеточных мембранах белков, специфически связывающих ДНК.
Путем эндоцитоза (впячивания внутрь клеточной мембраны) чу-
жеродная ДНК попадает в цитоплазму в составе эндосом, где
обычно быстро разрушается лизосомальными ферментами. Только
небольшая часть экзогенной ДНК выходит из эндосом, попадает
в ядро и, если не разрушается эндогенными нуклеазами, то мо-
жет быть интегрирована в ДНК клетки. Такое, однако, случает-
ся достаточно редко. Известное исключение составляют мышцы,
в которых благодаря низкой активности эндогенных нуклеаз и
низкой пролиферативной активности введенная ДНК долго (до 1
года) может сохраняться и даже экспрессироваться в миофиб-
риллах (Hansen et al.,1991).
Эффективная доставка чужеродной ДНК непосредственно в
ядро клетки-мишени может быть достигнута путем микроинъекции
(метод применяемый сегодня почти исключительно для создания
трансгенных животных путем введения экзогенной ДНК в пронук-
леус оплодотворенной яйцеклетки - cм.Главу VIII); при помощи
электропорации (кратковременного воздействия сильным элект-
рическим полем); путем перфорации клеточных мембран золотыми
или вольфрамовыми микрочастицами коньюгироваными с чужерод-
ными ДНК и разогнанными до высокой скорости (метод бомбарди-
ровки). Эти методы доставки применимы, главным образом, для
клеток, культивируемых in vitro. Исключение составляет лишь
метод бомбардировки, который при наличии специального генно-
го "ружья" с успехом применяется и in vivo (Yang et
al., 1990).
Для повышения эффективности переноса обычно используют
системы доставки - соединения или группы соединений, взаимо-
действующие с ДНК с образованием компактных структур, облег-
чающих проникновение ДНК в клетки и защищающих ее от дейс-
твия нуклеаз (Власова и др., 1994). Самой простой системой
доставки является система кальций-фосфатной копреципитации,
широко применяемая для трансфекции клеток in vitro. Более
сложный и многообещающий вариант трансфекции представляет
собой рецептор-опосредованный транспорт, предусматривающий
создание достаточно сложной, обычно трехкомпонентной конс-
трукции: ДНК-поликатион + лиганд + вирус (Рис. 9.2). В ка-
честве лигандов используются специфические белки, такие как
трансферрин, эритропоэтин, асиалоглюкопротеин, коньюгирован-
ный с альбумином инсулин и некоторые другие, взаимодействую-
щие с клеточными рецепторами и обеспечивающие фиксацию ген-
ной конструкции на специфических клетках, то есть адресную
доставку чужеродной ДНК в клетки определенного типа (напри-
мер асиалоглюкопротеин - в клетки печени, трансферрин и
эритропоэтин - в клетки крови и.т.д). Лиганды ковалентно
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73
