непосредственной близости от мутантного гена или, что еще
лучше, внутри него (чаще всего в интронах). При помощи этих
полморфных сайтов удается маркировать мутантные аллели гена
и проследить их передачу потомству (см. Главу 111). Ранние
иследования непрямым методом проводились почти исключительно
с использованием полиморфных сайтов рестрикции - двухаллель-
ной системы, информативная емкость которой не превышает 50%,
а реальное число гетерозигот по данному признаку в популя-
ции, зачастую, оказывается существенно ниже 0.5. Следова-
тельно, в лучшем случае только половина гетерозиготных носи-
телей наследственного заболевания, вызванного рецессивной
мутацией какого-нибудь гена, может быть доступна непрямой
молекулярной диагностике с использованием одного полиморфно-
го сайта рестрикции. Повышение информативности в случае
ПДРФ-анализа могло быть достигнуто только путем увеличения
числа полиморфных сайтов. Как првило, для диагностики необ-
ходим не один, а 3-4 полиморфных сайта, что далеко не во
всех случаях возможно. Многие из полиморфных сайтов локали-
зованы вне генов на расстояниях, при которых кроссинговер
может в заметном проценте случаев исказить результаты диаг-
ностики. Кроме того, практическое использование рестрикцион-
ных сайтов зачастую затруднено из-за отсутствия или большой
стоимостью соответствующих эндонуклеазных рестриктаз.
Все эти недостатки могут быть устранены при использова-
нии в качестве молекулярных маркеров высокополиморфных тан-
демно повторяющихся коротких три- и тетрамерных повторов
(STR) (см. Главу III). Для многих генов найдены уникальные
паттерны полиморфных аллелей, отличающихся по числу "коро-
вых" едининц повторяющихся последовательностей нуклеотидов.
Такие "количественные" полиморфизмы , как уже упоминалось
(см.Главу III), очень широко распространены по всему геному
и присутствуют в интронных и фланкирующих областях многих
генов. Появление в конце 1994г 0.7-сантиморганной карты ге-
нома человека, построенной на базе высокополиморфных динук-
леотидных (C-A)n повторов, сделало реальным маркирование,
практически, любого картированного гена. Особенную диагнос-
тическую ценность представляют внутригенные маркеры, для ко-
торых резко снижена вероятность кроссинговера с мутантными
аллелями гена, а следовательно, особенно высока точность ди-
агностики. Кроме того, как оказалось, многие внутригенные
полиморфные короткие тандемные повторы обнаруживают сильное
неравновесие по сцеплению с определенными мутантными аллеля-
ми гена, что значительно облегчает их идентификацию в отяго-
щенных семьях. Индекс гетерозиготности таких полиаллельных
мини- и микросателитных систем нередко превышает 0.8. Их
применение позволяет маркировать, то есть сделать информа-
тивными (см. 7.4) для ДНК-диагностики практически все семьи
высокого риска при условии наличия больного ребенка или дос-
тупности для молекулярного анализа его патанатомического ма-
териала .
Изучение полиморфных маркеров у больного пробанда и его
родителей и выяснение аллельной природы молекулярного марке-
ра, так называемое "определение фазы сцепления" (см.раздел
7.4), составляет основу для дальнейшей диагностики косвенны-
ми методами (Евграфов, Макаров,1987). Применение косвенных
методов молекулярной диагностики предусматривает также в ка-
честве обязательного предварительного этапа исследование
частоты аллелей соответствующих полиморфных сайтов в анали-
зируемых популяциях, среди больных и гетерозиготных носите-
лей мутаций, а также определение вероятности рекомбинации и
неравновесности по сцеплению между маркерными сайтами и му-
тантными аллелями гена. Такие исследования проводятся с по-
мощью методов блот-гибридизации по Саузерну, либо ПЦР
(см.разделы 1.3.; 1.7; 2,5). В первом случае в распоряжении
исследователя должны быть соответствующие ДНК-зонды, во вто-
ром - должны быть известны нуклеотидные последовательности
районов ДНК, включающие соответствующие полиморфные сайты,
для выбора олигопраймеров (см. Главы II,1V).
Раздел 7.2. ДНК-диагностика при различных типах насле-
дования.
Напомним, что значительное число моногенных заболеваний
наследуется по рецессивному типу. Это значит, что при ауто-
сомной локализации соответствующего гена болеют только гомо-
зиготные носители мутаций. Гетерозиготы клинически здоровы,
но с равной вероятностью передают своим детям мутантный или
нормальный варианты гена. Таким образом, на протяжении дли-
тельного времени мутация в скрытом виде может передаваться
из поколения в поколение. При аутосомно-рецессивном типе
наследования в родословных тяжелых больных, которые либо не
доживают до репродуктивного возраста, либо имеют резко сни-
женные потенции к размножению, редко удается выявить больных
родственников, особенно, по восходящей линии. Исключение
составляют семьи с повышенным уровнем инбридинга, который
возникает либо за счет высокой частоты близкородственных
браков, либо за счет вступления в брак людей из одинаковых
изолированных популяций ограниченной численности. Больные
дети с вероятностью 25 % рождаются в тех семьях, где оба ро-
дителя являются гетерозиготными носителями мутаций одного и
того же гена. Возможно также рождение больного ребенка в та-
кой семье, где только один из супругов несет мутацию, а вто-
рая мутация возникла в гамете его партнера в момент, пред-
шествующий оплодотворению. Доля таких семей в общей группе
риска относительно невелика, а риск повторного рождения в
них больного ребенка не превышает общей частоты спонтанного
возникновения мутаций в данном гене. Для болезней, сцеплен-
ных с полом, то есть контролируемых генами, локализоваными в
Х-хромосоме, характерно то, что болеют преимущественно маль-
чики, тогда как носителями являются девочки.
Y-хромосома содержит очень мало генов, большинство из
которых (около 10) картировано в так называемой псевдоауто-
сомной области короткого плеча, гомологичной таковой на ко-
ротком плече X-хромосомы. Важнейшим истинным геном Y-хромо-
сомы, то есть геном, представленным только на этой хромосо-
ме, является ген SRY (Yp21.1), детерминирующий развитие пола
по мужскому типу. Мутации этого регуляторного гена приводят
к нарушениям половой дифференцировки (XY-женщины), а его пе-
ренос вследствие ошибок рекомбинации псевдоаутосомных райо-
нов на короткое плечо X-хромосомы обусловливает синдром ре-
версии пола- Sex reverse (XX-мужчины) (McElreavey et al.,
1993). Практически важно, что присутствие даже небольшого
околоцентромерного фрагмента длинного плеча Y-хромосомы при
кариотипе XX является безусловным показанием для удаления
зачатков гонад у таких индивидуумов в связи с высокой веро-
ятностью экспрессии гена Gba, ведущего к их злокачественному
перерождению - гонадобластоме (Giquel et al., 1992). В отли-
чие от Y-хромосомы, большая по размеру X-хромосома человека
несет до 5% всех структурных генов, многие из которых уже
идентифицированы (см. Главу III).
Все рецессивные аллели Х-хромосомы у мальчиков проявляют-
ся, так как находятся в гемизиготном состоянии. Девочки мо-
гут болеть в том случае, если они гомозиготны по мутации.
Такая возможность может осуществиться в семье, где болен их
отец, а мать является носительницей мутации и передала доче-
ри свой мутантный аллель. Если отец больной девочки здоров,
можно предполагать, что мутация возникла в той его гамете,
которая участвовала в оплодотворении. Х-сцепленные заболева-
ния у девочек (миодистрофия Дюшенна, гемофилия А) могут быть
следствием сочетанного проявления мутации этих генов у одно-
го из родителей и делеции соответствующих фрагментов хромо-
сом у другого. В этих редких случаях у девочек, как и у
мальчиков, мутации Х-сцепленных генов будут находиться в ге-
мизиготном состоянии
При доминантном наследовании для развития болезни дос-
таточно одного мутантного аллеля. Такие больные с вероят-
ностью 50% рождаются в семьях, где один из родителей болен.
Очень редко больные дети с доминантным типом наследования
могут родиться и у здоровых родителей в результате мутирова-
ния одной из гамет. Однако, вероятность повторного рождения
больного ребенка в такой семье такая же, как и для популяции
в целом. Пренатальная диагностика доминантных болезней про-
водится достаточно редко по ряду причин. Во-первых, такие
болезни составляют относительно небольшой процент среди всех
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73
