любых моногенных заболеваний, но, что особенно существенно,
она делает реальной разработку стратегии картирования генов,
мутации которых предрасполагают к мультифакториальным забо-
леваниям, таким как диабет, гипертония, инфаркт миокарда,
психозы и многое другое.
Раздел 3.4 Хромосом-специфические библиотеки генов,
пульсирующий гель-электрофорез.
Используя столь обширную систему молекулярных маркеров
и проводя анализ сцепления на коллекциях клеточных культур
или на материале информативных родословных можно довольно
быстро привязать любой признак, особенно моногенный, не
только к определенной хромосоме, но даже к одному бэнду, оп-
ределить ближайшие фланкирующие маркеры и перейти не-
посредственно к позиционному клонированию с целью выделения
и идентификации самого гена. В этой связи важное значение в
картировании генов принадлежит молекулярно-цитогенетическим
подходам, являющимся принципиально важным звеном для успеш-
ного совмещения карт сцепления и физических карт целых хро-
мосом и их фрагментов.
Точность цитогенетического картирования определяется
степенью спирализации хромосом, характером использованной
метки и разрешающей способностью микроскопического оборудо-
вания. При картировании на стандартных метафазных хромосомах
и использовании радиоактивно меченых зондов точность карти-
рования ограничивается одним крупным бэндом или даже сегмен-
том хромосомы и составляет около 5-10 миллионов п.о. При
использовании биотиновой метки на прометафазных хромосомах
точность картирования возрастает в среднем в 5-10 раз (до 1
миллиона п.о.), а при работе со специально приготовленными и
растянутыми интерфазными хромосомами может доходить до 50
тысяч п.о.(Boehringer Mannheim Mannual,1992). Тем ни менее,
даже при такой разрешающей способности цитогенетическое кар-
тирование дает лишь весьма ориентировочные результаты и обы-
чно рассматривается как 1-й этап физического картирования.
Значительно более точные результаты достигаются на 2-м
этапе - этапе физического (рестрикционного) картирования.
Среднее расстояние между стандартными сайтами узнавания на
рестрикционных картах колеблется в пределах от 10 до 20 кб.
Из-за расхождений почти на два порядка масштабов цитогенети-
ческого и молекулярного картирования прямое сопоставление
этих типов физических карт практически невозможно.
Одним из способов преодоления этих трудностей является
конструирование хромосом-специфических библиотек генов. Как
уже упоминалось (см.Глава I,1.5) для приготовления таких
библиотек используют наборы клеточных линий соматических ги-
бридов с отдельными хромосомами человека либо хромосомы, ме-
ханически отобранные путем проточной цитометрии. Для некото-
рых видов молекулярного клонирования удобнее оказались биб-
лиотеки генов, построенные из субхромосомальных фрагментов.
Получение таких фрагментов достигается путем целенаправлен-
ного конструирования соматических гибридов, содержащих лишь
часть какой-либо хромосомы человека. Субхромосомные клоны
могут быть получены и с помощью микроманипуляций, при кото-
рых механически, под контролем микроманипулятора может быть
вырезан практически любой видимый фрагмент каждой хромосомы.
Разработаны также молекулярные методы выделения из генома и
идентификации крупных фрагментов ДНК, приближающихся по раз-
мерам к единичным хромосомным бэндам. Это стало возможным
после обнаружения редкощепящих рестриктаз, разрезающих ДНК
на фрагменты длиной от сотен тысяч до миллиона пар нуклеоти-
дов (Estivill, Williamson, 1987).
Другим важным шагом на пути клонирования и анализа
больших субхромосомальных фрагментов ДНК явилась разработка
методов их разделения путем гель-электрофореза в пульсирую-
щем поле (Barlow, Lehrach, 1987; Smith, Cantor, 1986; Smith
et al., 1987). В соответствии со стандартными методами
электрофореза под действием однонаправленного постоянного
поля в агарозном или в полиакриламидном гелях удается разде-
лять фрагменты ДНК размером не более 3 - 5 десятков килобаз.
Продвижение больших фрагментов ДНК в геле при пульсирующем
изменении направления электрического поля происходит, по
-видимому, за счет конформационных изменений, обусловленных
скручиванием и раскручиванием молекул ДНК в момент переклю-
чения направления поля. При этом более короткие молекулы
легче адаптируются к изменению условий и потому движутся в
геле быстрее. Существуют различные варианты пульсирующего
гель-электрофореза, главным образом, связанные с геометри-
ческим расположением направлений полей - ортогональный,
гексогональный, инверсионный. При использовании любого из
этих вариантов могут быть разделены молекулы ДНК размером от
50 кб до более, чем 9 миллионов п.о. Эффективность разделе-
ния фрагментов ДНК зависит не только от их размеров, но и от
условий проведения электрофореза (напряжение, температура
буфера, концентрация агарозы, время одного импульса). В ка-
честве маркеров для определения величины больших молекул ДНК
используют целые хромосомы дрожжей известной молекулярной
массы. В дальнейшем отбор крупных фрагментов ДНК, несущих
специфические последовательности, также может быть осущест-
влен путем блот-гибридизации с ДНК-зондами. Разделенные и
идентифицированные фрагменты ДНК могут быть элюированы из
геля и использованы для рестрикционного картирования, пост-
роения библиотек генов и для молекулярного клонирования с
целью идентификации и изоляции генных последовательностей. В
последнее время для изоляции крупных субхромосомальных сег-
ментов ДНК широко используется метод клонирования в
искусственных дрожжевых минихромосомах - YAC, и построения
библиотек генов на основе YAC-векторов.
Раздел 3.5 Позиционное клонирование, прогулка и прыжки
по хромосоме, идентификация и изоляция генов.
Мы уже упоминали, что средние размеры гена составляют
около 10-30 кб, варьируя в широких пределах (см.Глава II.2.
4). Единицы рекомбинации, размеры цитогенетических бэндов
и субхромосомных фрагментов ДНК измеряются миллионами пар
нуклеотидов, также как и размеры фрагментов ДНК, выделяемых
с помощью обработки геномной ДНК редкощепящими эндонуклеаза-
ми, пульсирующего электрофореза и клонирования в дрожжевых
минихромосомах. Переход от этих крупных фрагментов к после-
довательностям ДНК, сопоставимым с размерами гена, осущест-
вляют с помощью молекулярного клонирования, то есть получе-
ния набора фаговых или космидных клонов, содержащих относи-
тельно небольшие последовательности, насыщаяющие или пол-
ностью перекрывающие крупный сегмент ДНК, предположительно
содержащий идентифицируемый ген (Рис.3.5). Затем проводят
упорядочивание клонов в соответствии с взаимным расположени-
ем инсертированных в них фрагментов ДНК, осуществляя однов-
ременно молекулярный анализ этих фрагментов с целью иденти-
фикации регуляторных или кодирующих областей генов. Позднее
мы подробнее остановимся на тех критериях, с помощью которых
можно различить транскрибируемые и нетранскрибируемые участ-
ки генома. Для молекулярного клонирования используют различ-
ные подходы (Iannuzzi, Collins, 1990). Прежде всего, это
насыщающее клонирование, то есть изоляция из хромосом-специ-
фических библиотек нескольких сотен клонов с целью картиро-
вания различными методами инсертированных в них фрагментов
ДНК и идентификации клонов с последовательностями, локализо-
ванными в заданном районе. Значительно чаще используется
тактика скринирования фаговых, космидных и YAC библиотек,
сконструированных из субхромосомальных сегментов ДНК, пред-
варительно отобранных на основании сцепления с различными
ДНК-маркерами. При этом методы выделения субхромосомальных
сегментов ДНК могут быть самыми различными. Дальнейший поиск
в библиотеках генов клонов, содержащих транскрибируемые
последовательности ДНК, осуществляют достаточно трудоемкими
методами, получившими название "прогулки" и "прыжков" по
хромосоме.
"Прогулка" по хромосоме или скользящее зондирование
(Рис.3.6). заключается в последовательном отборе клонов, со-
держащих частично перекрывающиеся фрагменты ДНК из опреде-
ленного района генома (Rommens et al.,1989). На первом этапе
проводят скрининг библиотеки с помощью маркерной ДНК, сцеп-
ленной с геном. После нахождения положительных клонов
последние сами служат зондами для изоляции других клонов,
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73
