присоединяются к связывающим и компактизующим чужеродную ДНК
катионным носителям (полилизину, DEAE-Dextran и др.).
Важным компонентом системы является аденовирус или его
N-концевой фрагмент, выступающие в качестве эффективных фу-
зогенных агентов, обеспечивающих выход экзогенной ДНК из эн-
досом после попадания ее в цитоплазму клеток-мишеней. Адрес-
ная доставка и эффективная защита от лизосомальных ферментов
обеспечивают высокую трансфекционную способность таких конс-
трукций, их несомненную перспективность для генной терапии
in vivo (Hodgson, 1995).
Мы уже упоминали о возможности сочетания векторного и
физико-химического подхода при конструировании систем для
переноса генов в клетки человека. Одна из таких систем осно-
вана на использовании филаментного фага fd для трансфекции
эпителиальных клеток. Гены fd, кодирующие белки оболочки фа-
га, экспрессируются на его поверхности. В один из них инсер-
тируют последовательность, кодирующую поли-L-лизин. Полили-
зиновые остатки в составе слитого белка связываются с плаз-
мидной ДНК и удерживают ее на поверхности фага. В другой ген
оболочки фага инсертируют последовательость ДНК, кодирующую
какой-либо агент, специфически связывающийся с апикальной
поверхностью эпителиальных клеток и интернализирующий (обес-
печивающий проникновение) фага внутрь клетки. С этой целью
были апробированы гены белков патогенных бактерий, поражаю-
щих кишечный эпителий - интерналин и инвазин, а также после-
довательности ДНК, кодирующие пептидные фрагменты вариабель-
ного района моноклональных антител Ab11. Было показано, что
во всех трех случаях достигается адресная доставка и интер-
нализация фага в клетки-мишени, то есть система успешно
функционирует.
Направленный перенос генов во многие типы клеток, со-
держащие трансферриновые рецепторы, может быть осуществлен
при комплексировании ДНК с трансферрином. Использование в
этом комплексе аденовирусного вектора существено облегчает
прохождение ДНК через эндосомы и попадание её в ядро. Иде-
альными белковыми лигандами для специфических клеточных ре-
цепторов могут служить моноклональные антитела или их фраг-
менты, направленные против тех элементов рецепторов, которые
находятся на наружной поверхности клеточной мембраны. Подоб-
ная система разработана для рецептор-опосредованного генного
переноса в эпителиальные клетки. Она основана на использова-
нии противо-секреторных SCFab-фрагментов антител для поли-
мерного иммуноглобулинового рецептора pIgR. Этот рецептор
транспортирует IgA и IgM в респираторные эпителиальные клет-
ки, связывая иммуноглобулины и интернализируя их путем эндо-
цитоза. Показано, что в системе in vitro частота трансфекции
эпителиальных клеток при использовании SCFab-поли-L-ли-
зин-ДНК комплекса такая же, как и при введении экзогенной
ДНК посредством трансферринового рецептора. Аналогичные под-
ходы могут быть применены для введения генов и в другие типы
клеток.
9.4.3 Липосомный метод трансфекции.
Эффективный внутриклеточный транспорт и защита от дег-
радации лизосомальными ферментами достигаются при использо-
вании в качестве векторов липосом-липидных пузырьков, обла-
дающих выраженными фузогенными свойствами - способностью
сливаться с клеточными мембранами. Особенно перспективны в
этом отношении липосомы, полученные на основе катионных ли-
пидов, обеспечивающих 100% связывание ДНК в конденсированные
нуклеолипидные частицы. Положительный заряд на поверхности
таких пузырьков обеспечивает их активное слияние с отрица-
тельно заряженными клеточной мембранами и прямое попадание
чужеродной ДНК в цитоплазму, минуя эндосомы и, соответствен-
но, не подвергаясь действию лизосомных гидролаз. Очень эф-
фективный перенос высокоочищенных ДНК или РНК-последователь-
ностей в соматические, особенно, в мышечные ткани может быть
осуществлен с помощью препаратов липофектина или липофекта-
мина (Caplen et al., 1994). Гораздо более высокая частота
трансфекции по сравнению с липосом-опосредованным переносом
получена в экспериментах на культурах клеток при использова-
нии ДНК-липидного комплекса с циклическим амфипатическим
пептидом грамицидином S.
Особенно перспективными в последнее время представляют-
ся комплексы, в которых липосомы коньюгируют с мембранными
антителами к определенным белкам-мишеням (иммунолипосомы)
либо с белками-лигандами (см.выше). Эти конструкции обеспе-
чивают эффективную адресную доставку чужеродной ДНК в клет-
ки-мишени. Подобная схема была успешно апробирована для пе-
реноса гена сывороточного альбумина человека в гепатоциты
линейных крыс Nagase с наследственной дисальбуминемией. До-
казано присутствие и экспрессия введенного таким образом ге-
на человека в клетках печени крыс. Аналогичные результаты
получены в опытах на линейных кроликах Watanabe, дефектных
по рецепторам липопротеинов низкой плотности - LDL. Эти жи-
вотные моделируют одно из наиболее частых моногенных заболе-
ваний человека - семейную гиперхолесеринемию. При внутривен-
ной иньекции кроликам липидного асиалогликопротеинового
комплекса с плазмидной ДНК, несущей нормальный LDL-ген, уро-
вень холестерина в крови животных устойчиво понижался.
Важным преимуществом рецептор-опосредованных систем на
основе липосом является их низкая иммунореактивность. Они
лишены и многих других недостатков, свойственных вирусным
векторным системам. Вместе с тем, до сих пор не решена проб-
лема низкой частоты трансформации клеток при липосомном пе-
реносе. Это обстоятельство существенно ограничивает примене-
ние липосом в генной терапии (Crystal, 1995). Тем ни менее,
в настоящее время рецептор-опосредованный вариант передачи
генетической информации в клетки эукариот с использованием в
качестве лигандов специфических антител, рецепторных белков,
а также вирусных последовательностей и липосом позволяет в
одной системе совместить преимущества физико-химических ме-
тодов переноса ДНК и вирусных векторов и потому представляет
один из наиболее перспективных и быстро развивающихся нап-
равлений в трансфекции эукариотических клеток.
9.4.4 Рекомбинантные вирусы.
Конструирование векторов на базе вирусов представляет
собой наиболее интересный и перспективный раздел генотера-
пии. Эволюционно сложившаяся система обеспечения эффективно-
го проникновения в клетки-мишени, а в случае ретровирусов и
система интеграции в клеточный геном, позволяет рассматри-
вать вирусы как естественные векторы чужеродной ДНК для кле-
ток млекопитающих. Действительно, только с помощью вирусных
векторов пока удается достичь такого уровня трансфекции кле-
ток человека in vitro и in vivo, который необходим для про-
явления лечебного эффекта. Это доказывают многочисленные
эксперименты на животных и первые клинические испытания ут-
вержденных программ генотерапии (см. 9.2). Вместе с тем,
нельзя недооценивать и вполне реальную опасность патологи-
ческих процессов, связанных с использованием вирусных час-
тиц. В качестве векторов применяют следующие рекомбинантные
вирусы: ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные виру-
сы, вирус герпеса, вирус спида (HIV), вирус ветряной оспы и
некоторые другие (Anderson, 1992; Culver, 1994; Lowenstein,
1994; Hodgson, 1995; Kay, Woo, 1992). Учитывая большую прак-
тическую значимость этих векторов, рассмотрим их более под-
робно.
_Ретровирусные векторы. . Генные конструкции на основе
ретровирусов (РНК-содержащих вирусов) особенно часто исполь-
зуются для трансдукции ДНК ex vivo. Наиболее популярный рет-
ровирусный вектор - вирус мышиного лейкоза Molony (MoMLV).
По сравнению с другими типами векторов ретровирусы обладают
уникальной способностью эффективно переносить чужеродные ге-
ны и стабильно интегрировать их в геном делящихся соматичес-
ких клеток. Для безопасности ретровирусные последовательнос-
ти модифицируют таким образом, что в инфецированных ими
клетках вирусные белки не производятся. Это достигается за
счет удаления или инактивации всех кодирующих последователь-
ностей вируса. Репликация вирусных векторов может происхо-
дить только в специальных "пакующих" клетках, в геном кото-
рых встроены все гены, производящие вирусные белки. При вве-
дении ретровирусных векторов в эти клетки образуются вирио-
ны, несущие векторную РНК и способные лишь проникать в клет-
ки-мишени, но не размножаться в них. Недостатком этой систе-
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73
