человека (Sikela, Auffray, 1993). Эти кДНК составляют при-
мерно 10-15% всех кодирующих последовательностей генома. Ме-
тодом гибридизации in situ уже идентифицировано более 2000
генов, для многих из которых пока не найдено сцепление с по-
лиморфными маркерами (Poduslo et al., 1991). Такие кодирую-
щие последовательности присутствуют на карте генов человека,
но их пока нет на картах сцепления.
Раздел 3.3 Генетические индексные маркеры.
Как мы уже отмечали раньше, успешная локализация неиз-
вестного наследственного признака (гена) в значительной сте-
пени определяется присутствием на карте фланкирующих марке-
ров, находящихся на относительно небольшом расстоянии по обе
стороны от гена. В качестве генетических маркеров специфи-
ческих участков хромосом могут быть использованы любые лока-
лизованные в этих участках элементы генома с высоким уровнем
легко идентифицируемой популяционной изменчивости или поли-
морфизма. Отбор сцепленных с картируемым признаком генети-
ческих маркеров производят по результатам совместного анали-
за их сегрегации в информативных семьях.
Значительные успехи в геномном картировании были связа-
ны с использованием в качестве генетических маркеров широко
распространенной во многих популяциях изменчивости по изо-
ферментному спектру различных белков. Оказалось, что многие
ферменты у разных индивидуумов, в разных тканях и на разных
стадиях онтогенеза могут находиться в различных изоформах.
Такие варианты одного и того же белка обычно не отличаются
по специфической активности, но имеют измененную электрофо-
ретическую подвижность. Популяционный анализ изоферментов
обнаружил существование полиморфизма для очень многих белко-
вых систем, контролируемых разными генами, локализованными
во многих хромосомах. Таким образом, для этих хромосом были
найдены генетические маркеры, с помощью которых были иденти-
фицированы соответствующие группы сцепления.
Совершенствование молекулярных методов анализа специфи-
ческих последовательностей ДНК привело к обнаружению большо-
го числа высокоизменчивых участков генома - полиморфных сай-
тов рестрикции, гипервариабельных мини- и микросателлитных
последовательностей (см.Главу II) Эта изменчивость также бы-
ла использована для маркировки участков хромосом с целью
установления более точного взаиморасположения локусов. Вско-
ре после обнаружения полиморфных сайтов рестрикции были
опубликованы теоретические рассчеты, согласно которым от 10
до 20 таких локусов, расположенных равномерно на каждой хро-
мосоме на расстоянии около 20 сМ друг от друга, достаточно
для определения хромосомной принадлежности генов, от-
ветственных за любой тип наследственной изменчивости
(Botstein et al,1980). По этим оценкам около 200 таких ин-
дексных маркеров позволят построить карты сцепления для всех
известных генов на основании анализа сегрегации соответству-
ющих признаков в семьях с большим числом мутантов. Для опре-
деления порядка расположения генов на хромосомах и оценки
генетических расстояний между ними достаточно около 400 рав-
номерно распределенных полиморфных маркеров.
Идентификация в геноме человека большого числа поли-
морфных сайтов рестрикции и разработка простых методов ана-
лиза индивидуальной изменчивости по этим локусам существенно
повысили возможности локализации неизвестных признаков на
геномных картах. Уже к 1989г. были картированы более 2000
клонированных последовательностей ДНК, обнаруживающих поли-
морфизм по длине рестрикционных фрагментов (ПДРФ) в различ-
ных популяциях (Kidd et al., 1989). Более 1000 из них типи-
ровано в CEPH-коллекциях родословных. В значительной степени
это анонимные последовательности, связь которых со специфи-
ческими генами не установлена. Их наименования чаще всего
соответствуют названию отобранного из библиотеки генов кло-
на. В дальнейшем была разработана стандартная генетическая
номенклатура для обозначения используемых в качестве марке-
ров сегментов ДНК с неизвестной функцией. Первая буква D,
что значит ДНК, затем номер хромосомы, далее S для уникаль-
ных и Z для повторяющихся последовательностей и в конце но-
мер, идентифицирующий данный зонд в определенном районе ДНК.
Применение полиморфных сайтов рестрикции в качестве ге-
нетических маркеров имеет два ограничения: сравнительно низ-
кая информативность (частота гетерозигот не может превышает
50%- см. Главы II, Y) и неравномерное распределение
ПДРФ-сайтов по хромосомам. Этих недостатков практически ли-
шены гипервариабельные STR-сайты (ди-, три- и тетрануклеа-
тидные повторы). Использование микро- и минисателлитных ДНК
последовательностей в качестве индексных генетических марке-
ров открыло новую эру в построении карт сцепления генома че-
ловека. В настоящее время работа по идентификации высокопо-
лиморфных маркеров, перекрывающих весь геном и равномерно
распределенных по хромосомам практически завершенаа
(Weissenbach et al.,1992; Reed et al.,1994). Эта система
построена на базе динуклеотидных (C-A)n повторов.
(C-A)n*(G-T)n представляют собой наиболее частый класс
простых повторов, обнаруженных в геноме человека (за исклю-
чением An* Tn мультимеров). Такие повторы присутствуют при-
мерно в 1% колоний из геномных библиотек, сконструированных
на базе фрагментов длиной 300 - 500 п.о., которые образуются
после переваривания геномной ДНК эндонуклеазой Alu1. Более
90% из них оказываются полиморфными по числу копий в класте-
ре, причем в 70% локусов присутствует более трех аллелей. В
1992г. группе французских ученых под руководством Жана
Вайссенбаха удалось разработать систему идентификации с по-
мощью ПЦР индивидуальной изменчивости в местах локализации
(C-A)n повторов и на этой основе создать геномную карту из
814 высокополиморфных индексных маркеров со средним расстоя-
нием между ними около 5 сМ, получившую название
Genethon-коллекции микросателлитных маркеров (Weissenbach et
al., 1992). Для этого были просеквенированы более 12 000
фрагментов ДНК, выделенных из геномной Alu1-библиотеки путем
ее скрининга poly(dC-dA)*poly (dG-dT) ДНК-зондом. Праймеры
для амплификации подбирали из последовательностей ДНК, окру-
жающих повторы, используя для этого компьютерные программы.
Для дальнейшего анализа было отобрано около 3 000
(C-A)n-сайтов и проведена специфическая амплификация этих
участков у четырех неродственных CEPH-индивидуумов. На сле-
дующем этапе была определена хромосомная принадлежность по-
лутара тысяч наиболее информативных маркеров путем их иден-
тификации в панели из 18 соматических гибридных клонов, со-
держащих разные наборы хромосом человека. Детальная карта
сцепления индексных маркеров построена по результатам их ге-
нотипирования в коллекции 8 самых больших CEPH-родословных.
Предложенная система маркеров перекрывает все хромосомы, а
суммарное расстояние между ними соответствует примерно 90%
всего генома человека.
К 1994г. число индексных STR-маркеров было увеличено до
2 066, а средний интервал между соседними локусами уменьшен
до 2,9 сМ (Gyapay et al.,1994). В последнее время перспекти-
вы широкомасштабного картирования всего генома человека ста-
ли еще более значительны. Группой английских авторов под ру-
ководством Дж.Тодда была разработана система автоматического
скринирования 254 динуклеотидных маркеров, перекрывающих
весь геном человека со средним расстоянием между соседними
маркерами около 13 сМ. 80% этих повторов было отобрано из
Genethon-коллекции маркеров, остальные - из других источни-
ков (Genome Data Base, Baltimore). Амплификацию всех 254 по-
лиморфных сайтов проводили в 39 мультиплексных ПЦР (МПЦР),
причем используемые для этих целей олигопраймеры были мечены
четырьмя типами флюорохромов, так что аллели даже одинаково-
го молекулярного веса можно было различить на электрофорег-
рамме по цвету. В каждой из 39 МПЦР скринировали 7 - 9
STR-сайтов какой-то определенной хромосомы. Такие МПЦР-набо-
ры были разработаны для всех 22 аутосом и для Х-хромосомы.
Регистрация аллелей всех STR проводилась автоматическим
сканнером с использованием компьютерной программы Genotyper.
Только с помощью одного автоматического сканнера удается
проанализировать по этой схеме более 2.5 тысяч генотипов в
день! (Reed et al.,1994). Такая система уже сегодня открыва-
ет самые широкие возможности не только для генетического
картирования и создания подробных карт сцепления практически
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73
