дится в пределах 70-85%. В Европе частота мутации обнаружи-
вает определенный градиент распространения с севера на юг и
с запада на восток, достигая 85% в Дании она уменьшается до
50% в Италии и до 20-30% в Турции. В Европейской части
России она составляет около 50% всех мутантных (CF) хро-
мосом. У евреев-ашкенази доминируюшей по частоте является
мутация W1282X (33%).
Биохимический анализ клеток пациентов, больных муко-
висцидозом, позволил выяснить фенотипические особенности
экспрессии мутантных аллелей гена ТРБМ, установить опреде-
ленный градиент патологических нарушений на мембранном, кле-
точном и организменном уровнях в зависимости от типа мута-
ции, её локализации и структуры аномального белкового про-
дукта (Баранов, Гинтер,1994). Так, было установлено, что не-
которые CFTR- мутации, в том числе и delF508, не препятствуя
трансляции, нарушают процессинг белка так, что он не дости-
гает апикальной мембраны и не создает хлорный поток. Этим
объясняется тяжелая клиника муковисцидоза при подобных нару-
шениях (Sheppard et al.,1993). Другие мутации ( R117H, R334W
и R347P), выявленные при более мягких формах заболевания, не
затрагивают процессинга белка, хлорный канал формируется, но
функционирует менее эффективно, чем в норме. Сопоставление
процессинга, локализации и функционирования белка в 3-х ли-
ниях L-клеток, трансдуцированных нормальным CFTR-геном и
двумя его аллельными вариантами, показало, что дефект одной
из мажорных мутаций - G551D, связан с частичной инактивацией
функции хлорного канала, в то время как delF508, как оказа-
лось, обладает комбинированным эффектом - нарушает локализа-
цию и стабильность белка и снижает эффективность его функци-
онирования в качестве хлорого канала (Yang et al., 1993).
Интересно, что мутация R117H в гомозиготном состоянии, чаще
в компаунде с другими аллелями, в том числе с delF508, обна-
руживается у пациентов с врожденным отсутствием семявыводя-
щих канальцев (vas deferens). При этом клиника муковисцидоза
у таких пациентов, как правило, отсутствует или очень стер-
та. Это еще один из примеров фенотипического разнообразия,
обусловленного аллельными сериями.
В настоящее время в России доступны идентификации по
наличию известных мутаций около 65% больных муковисцидозом
(Иващенко,1992; Потапова,1994). Диагностическая ценность
основных мажорных мутаций в порядке убывания их частоты сле-
дующая delF508 (50%), 3732delA (4,3%), W1282X (2,4%),
394delTT (2,1%); G542X (2,0%) (Иващенко, 1992). Cогласно на-
шим данным (Баранов, 1994) молекулярная диагностика муко-
висцидоза прямыми методами возможна примерно в 55 -60% се-
мей. В случае непрямой диагностики используются полиморфные
сайты локусов ДНК, расположенные в непосредственной близости
(IRP, D7S8, D7S23, MET) или внутри самого гена CFTR - ми-
нисателлитные последовательности в интронах 6, 8, 17b гена
СFTR (Zielenski et al., 1991; Morral et al., 1991; Chehab et
al., 1991; Агбангла и др., 1992; Potapova et al., 1994). При
отсутствии мажорных мутаций и информативности по полиморфным
сайтам молекулярные исследования могут быть дополнены биохи-
мическим анализом амниотической жидкости на содержание фер-
ментов микроворсинок кишечника плода (Гобунова и др.,1989;
Баранов и др.,1991).
Методами направленного мутагенеза (gene targeting
см. Главу VIII) в различных лаборатория США и Великобритании
осуществлено успешное конструирование трансгенных моделей
муковисцидоза на мышах (Clarke, et al., 1992; Colledge et
al., 1992; Dorin et al., 1992; Snouwaert et al., 1992). Вы-
яснены признаки сходства и некоторые межвидовые различия
проявления мутации гена CFTR у мышей и человека. Показано,
что различные мутации этого гена по-разному реализуются в
фенотипе СFTR дефицитных мышей. Так, в одной из трансгенных
линий отмечено преимущественное поржаение легких, у других -
поджелудочной железы и кишечника. В одной мутантной линии
наблюдается гибель большого числа зародышей от причин, сход-
ных с мекониальным илеусом. Таким образом, эти линии
представляют собой идеальные модели для исследования молеку-
лярных основ патогенеза муковисцидоза, а также для разработ-
ки и испытания терапевтических мероприятий, включая геноте-
рапию. Как уже отмечалось в предыдущей главе, программы ге-
нотерапии муковисцидоза реализуются по крайней мере в 7
центрах США и двух центрах Западной Европы (Великобритания и
Франция). Уже успешно осуществлены не только апробации ген-
ноинженерных конструкций на мутантных культурах клеток и мо-
дельных животных, но начаты и успешно проводятся клинические
испытания генотерапевтического лечения муковисцидоза на 70
пациентах. Исследования по генотерапии муковисцидоза, нача-
тые в нашей стране пока проводятся на уровне клеточных куль-
тур.
10.4.2 Миодистрофия Дюшенна.
Миодистрофия Дюшенна - сцепленная с полом мышечная
дистрофия; выделяют две клинические формы: тяжелую - мио-
дистрофию Дюшенна (МД) и гораздо более мягкую - миодистрофию
Беккера (МБ). Ген миодистрофии Дюшенна (DMD) - один из самых
крупных известных генов человека, кодирует белок дистрофин,
входящий в состав сарколеммы мышечного волокна. При МД дист-
рофин либо полностью отсутствует, либо деградирует вскоре
после синтеза. При форме Беккера, как правило, дистрофин
присутствует, хотя и в измененном, чаще всего в укороченном
состоянии.
В соответствии с современными представлениями (Ahn,
Kunkel, 1993) огромный DMD-ген находится под контролем слож-
ной системы регуляции транскрипции и сплайсинга. По крайней
мере, 5 независимых промоторов осуществляют альтернативную
специфическую транскрипцию первых экзонов в разных тканях и
на разных стадиях эмбрионального развития. 3 промотора
экспрессируют полноразмерную молекулу дистрофина, в то время
как 2 осущесвляют экспрессию последних доменов взаимоисклю-
чающим способом. Высоко консервативные последовательности 6-
и экзонов, кодирующих C-конец белка, альтернативно сплайси-
руются, образуя несколько структурно различающихся форм
дистрофина, осуществляющих различные функции. Так, идентифи-
цирована 6.5-кб мРНК, транскрибируемая с DMD-гена и являюще-
еся, по-видимому, его основным продуктом в не-мышечных тка-
нях, включая мозг (Bar et al.,.1990). Соответствующий белок
значительно отличается от дистрофина и его уровень в некото-
рых не-мышечных тканях сопоставим с количеством дистрофина в
мышцах. Описан также 4.8-кб транскрипт того же локуса,
экспрессирующийся во многих типах тканей, но особенно в
Шванновских клетках проводящей нервной системы, где сам
дистрофин отсутствует (Blake et al., 1992). Этот белок полу-
чил название апо-дистрофин-1. Клонирован и секвенирован еще
один 2.2-кб транскрипт DMD-гена, кодирующий аподистро-
фин-3, экспрессирующийся в позднем эмбриогенезе (Tinsley et
al., 1993).
В 60% случаев в гене DMD у больных мальчиков обнаружи-
ваются протяженные делеции, захватывающие от одного до
нескольких соседних экзонов и сосредоточеные, обычно, в двух
"горячих" районах - в области 5'-конца гена (экзоны 6-19) и
в 3'- конце (экзоны 40-53), при этом 30% делеций локализова-
ны в проксимальной части гена и 70% - в дистальной. Прокси-
мальные делеции возникают, по-видимому, в раннем эмбриогене-
зе и имеют больше шансов стать "семейными" мутациями.
Дистальные делеции возникают позднее и чаще встречаются, как
изолированные случаи. Считается, что в спорадических случаях
повторный риск рождения больного ребенка при проксимальной
делеции составляет 30%, тогда как при дистальной - только 4%
(Passos-Bueno et al., 1992).
Отмечены популяционные особенности паттерна делеций в
разных европейских популяциях, а также в популяциях России и
стран СНГ (Baranov et al., 1993). У некоторых пациентов де-
летирован не только весь ген, но достаточно протяженные
соседние области. Очень часто концы делеций локализованы в
центральной части дистрофинового гена. Так в интроне 44,
протяженностью 160-180 кб, расположено около 30% точек раз-
рыва всех делеций. Показано, что проксимальный конец одной
из делеций в интроне 43 расположен внутри транспозон-подоб-
ного элемента, принадлежащего THE-1 семейству ретротранспо-
зонов (Pizzuti et al.,1992). Описан еще один пациент, у ко-
торого делеция оканчивается в THE-1 элементе. Эти элементы,
размером 2.3 кб, фланкированные 350-нуклеотидными LTR, пов-
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73
