могут служить самые разные соматические клетки, как несущие
дефектный ген, так и нормальные клетки, приобретающие тера-
певтические свойства после трансфекции. В зависимости от
способа введения экзогенных ДНК в геном пациента генная те-
рапия может проводиться либо в культуре клеток (ex vivo),
либо непосредственно в организме (in vivo). Клеточная генная
терапия или терапия ex vivo предполагает выделение и культи-
вирование специфических типов клеток пациента, введение в
них чужеродных генов, отбор трансфецированных клеток и реин-
фузию их тому же пациенту (Рис. 9.1). В настоящее время
большинство допущенных к клиническим испытаниям программ
генной терапии использует именно этот подход (Cul-
ver, 1994). Осуществление таких программ возможно лишь в
крупных специализированных центрах, требует больших матери-
альных затрат и высоких биотехнологий.
Генная терапия in vivo основана на прямом введении кло-
нированных и определенным образом упакованных последователь-
ностей ДНК в специфические ткани больного. При этом вводимые
ДНК, как правило, интегрируют с молекулами, обеспечивающими
их адресную доставку в клетки-мишени (см. 9.3). Этот очень
перспективный подход, расчитанный на массовое лечение широко
распространенных заболеваний, пока реально апробирован толь-
ко для лечения муковисцидоза (Crystal et al., 1994). Особен-
но перспективным для лечения генных болезней in vivo предс-
таляется введение генов с помощью аэрозольных или иньецируе-
мых вакцин. Аэрозольная генотерапия разрабатывается, как
правило, для лечения пульмонологических заболеваний, таких
как муковисцидоз, энфизема, рак легких, при которых обьекта-
ми генетической модификации являются специфические типы ле-
гочных клеток (Hoffman, 1991). Иньецируемые вакцины могут
использоваться для модификации различных типов клеток и со
временем, по-видимому, станут наиболее распространенным и
универсальным способом доставки чужеродного генетического
материала в любые ткани.
Эффективность курса генной терапии в значительной сте-
пени зависит от правильного выбора типов соматических кле-
ток, в которых должна бать проведена генетическая модифика-
ция. Так например, при лечении какого-либо наследственного
заболевания, обусловленного дефектом секреторного белка, ге-
нетической коррекции, в принципе, могут быть подвергнуты лю-
бые клетки, тогда как для нерастворимых или мембран-связан-
ных белков выбор ограничен теми клетками, где экспрессирует-
ся соответствующий ген (см.раздел 8.5). Разработке программы
генной терапии предшествуют тщательный анализ тканеспецифи-
ческой экспрессии соответствующего гена, идентификация пер-
вичного биохимического дефекта, исследование структуры,
функции и внутриклеточного распределения его белкового про-
дукта, а также биохимический анализ патологического процес-
са. Все эти данные учитываются при составлении соответствую-
щего медицинского протокола. Кроме того, план генотерапевти-
ческих вмешательств определяется также доступностью кле-
ток-мишеней, периодом их жизни и характером миграции в орга-
низме, эффективностью и специфичностью трансфекции кле-
ток, длительностью экспрессии введенного гена.
Наиболее перспективной представляется возможность гене-
тической модификации не самих уже дифференцированных клеток
с наследственным дефектом, а их предшественников, то есть
долго живущих стволовых клеток. В частности, многообещающей
является трансформация тотипотентных эмбриональных стволовых
клеток, которые при создании определенных микроусловий могут
дифференцироваться, практически, в любые соматические клетки
организма (Hodgson, 1995). Следует упомянуть в этой связи
предложенный недавно эффективный метод получения стволовых
клеток гемопоэтического ряда, перспективных для генотерапии
наследственных заболеваний крови (Berardi et al., 1995).
Как правило, определение типа клеток, подлежащих гене-
тической модификации, завершается оценкой результатов пере-
носа гена в системе in vitro и проведения экспериментов на
животных моделях в тех случаях, когда это возможно. Апроба-
цию процедуры генокоррекции наследственного заболевания про-
водят на первичных культурах экспрессирующих клеток больного
либо на перевиваемых культурах, полученных после предвари-
тельной трансформации первичных культур. На этих клеточных
моделях оценивают эффективность выбранной системы переноса
экзогенной ДНК, определяют экспрессию вводимой генетической
конструкции, анализируют ее взаимодействие с геномом клет-
ки, отрабатывают способы идентификации первичного дефекта и
его коррекции на биохимическом уровне.
Однако, многие проблемы генной терапии не могут быть
решены на уровне клеток. Важное значение имеет анализ влия-
ния введенных ДНК-последовательностей на межклеточные взаи-
модействия, определяющие работу соответствующих тканей и ор-
ганов. Такие исследования могут быть проведены только in vi-
vo. Так, например, в культуре клеток можно определить коли-
чество синтезированного белка, необходимое для нормализации
биохимического дефекта, но этих данных недостаточно для от-
вета на вопрос, какое количество клеток в организме должно
быть модифицировано для восстановления нарушенной функции.
Используя культуры клеток, можно разработать биохимическую
систему адресной доставки рекомбинантных ДНК, однако, про-
верка надежности работы этой системы может быть осуществлена
только на уровне целого организма. Показатели длительности и
характера экспрессии введенного гена в культуре клеток могут
использоваться лишь в качестве ориентировочных параметров
для оценки необходимой периодичности повторения терапевти-
ческих процедур. Кроме того, многие побочные эффекты и, в
первую очередь, возможные ошибки в регуляции эспрессии чуже-
родного гена и опасность вирусной контаминации в результате
использования компетентного по репликации вектора (см.ниже),
могут быть выявлены только in vivo. Поэтому такое внимание в
программах по генной терапии уделяется экспериментам in vivo
на естественных или искусственно полученных моделях соот-
ветствующих наследственных болезней у животных (см.Главу
VIII). Успешная коррекция генетических дефектов у таких жи-
вотных и отсутствие нежелательных побочных эффектов генной
терапии является важнейшей предпосылкой для разрешения кли-
нических испытаний.
Раздел 9.3 Методы генетической трансфекции в генной те-
рапии.
Решающим условием успешной генотерапии является обеспе-
чение эффективной доставки, то есть трансфекции (в широком
смысле) или трансдукции (при использовании вирусных векто-
ров) чужеродного гена в клетки-мишени, обеспечение длитель-
ной персистенции его в этих клетках и создание условий для
полноценной работы, то есть экспрессии. Трансфекция может
проводиться с использованием (1) чистой ("голой"-naked) ДНК,
лигированной в соответствующую плазмиду, либо (2) комплекси-
рованной ДНК - плазмидная ДНК комплексированная с солями,
белками (трансферрином), органическими полимерами (DEAE -
декстраном, полилизином, липосомами или частицами золота),
либо (3) ДНК в составе вирусных частиц, предварительно ли-
шенных спсобности к репликации. Залогом длительной персис-
тенции чужеродной ДНК в клетках-реципиентах является ее
встраивание в геном, то есть в ДНК клетки-хозяина. Пребыва-
ние экзогенной ДНК в ядре в свободном состоянии (в виде, так
называемых, эписом) с неизбежностью ведет к ее элиминации
даже в неделящихся клетках и, соответственно, к транзиторной
экпрессии (обычно, в течение нескольких месяцев). Необходи-
мой предпосылкой экспрессии чужеродной ДНК является наличие
соответствующих промоторов, причем в случае наличия тканес-
пецифических промоторов можно добиться экспрессии введенного
гена только в определенных тканях и клетках (см.ниже). Ос-
новные методы доставки чужеродных генов в клетки подразделя-
ются на химические, физические и биологические. Эффектив-
ность трансфекции и интеграционная способность трансдуциро-
ванной чужеродной ДНК при различных способах трансфекции в
ДНК-клетки мишени приведены в Табл.9.1.
Таблица 9.1. Основные характеристики генетической трансфек-
ции in vitro (Culver, 1994).
--------------------T------------T-------------T------------¬
¦ Методы ¦ Трансдукция¦ Иинтеграция ¦Экспрессия ¦
+-------------------+------------+-------------+------------+
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73
