водят обработку векторной ДНК и клеток хозяина буферными
растворами, повышающими проницаемость клеточных и ядерных
мембран (метод кальций-фосфатной преципитации,
DEAE-декстран-опосредованная трансфекция). Во втором случае
используют краткосрочное физическое воздействие на клетки
для создания в мембранах микропор, проходимых для макромоле-
кул ДНК (метод электропорации - воздействие высоковольтным
электрическим полем, "бомбардировка" частицами золота и
т.п.). Более подробно проблемы векторов и методы генетичес-
кой трансфрмации (трансдукции) рассмотрены в Главе IX. Воп-
росам молекулярного клонирования также посвящена обширная
литература (Гловер, 1988; 1989; Шишкин, Калинин, 1992; Мани-
атис и др., 1984; Дейвис, 1990; Sambrook et al., 1989).
1.5 Геномные и к-ДНК-овые библиотеки генов, их скрининг.
Рассмотрим более подробно методы выделения и идентифи-
кации фрагментов ДНК, необходимых для анализа или для
использования в качестве ДНК-зондов. Основным источником
этих фрагментов являются искусственным образом сконструиро-
ванные библиотеки генов, в которых осуществляют поиск или
скрининг нужных последовательностей ДНК разными методами в
зависимости от специфических особенностей этих последова-
тельностей. Библиотека генов это полный набор клонированных
перекрывающихся фрагментов ДНК, полученных в результате
рестрикции или механического разрезания тотальной ДНК, выде-
ленной из какого-либо специфического источника. В зависи-
мости от происхождения ДНК различают геномные и кДНК-овые
библиотеки генов. Для конструирования геномных библиотек ис-
пользуют ДНК, выделенную из тканей, культур клеток, из от-
дельных хромосом или из их фрагментов. При создании кДНК
-овых библиотек выделяют тотальную мРНК из тканей или куль-
тивируемых клеток, в которых заведомо экспрессируются инте-
ресующие исследователя гены. На следующем этапе методом об-
ратной транскрипции (РНК-ДНК) синтезируют кДНК. Затем её
разрезают и упаковывают в выбранный для клонирования вектор.
Схема конструирования геномных и кДНК-овых библиотек предс-
тавлена на рис.1.6. Как видно на схеме в геномных библиоте-
ках присутствуют не только кодирующие последовательности ге-
нов, но также несмысловые внутригенные последовательности -
интроны и межгенные участки ДНК, причем удельный вес некоди-
рующих фрагментов ДНК значительно выше. кДНК-овые библиотеки
состоят только из кодирующих - экзонных, областей генов. На-
иболее удобный размер инсертируемой ДНК сопоставим со сред-
ним размером гена млекопитающих и составляет 15 - 25 тысяч
пар оснований (kb). Оптимальный по размеру набор перекрываю-
щихся последовательностей геномной ДНК человека получается
после ее переваривания частощепящими рестриктазами Sau3a или
Mbo1. Информационная емкость каждой библиотеки, то есть ко-
личество клонов с различными инсертированными фрагментами
ДНК, определяется размерами исходного генома и необходи-
мостью присутствия каждой его последовательности хотя бы в
одном клоне. Поэтому достаточно представительные геномные
библиотеки млекопитающих обычно содержат не менее 8*10!5 -
10!6 различных клонов.
Чаще библиотеки конструируют на основе фаговых или
космидных клонирующих векторов, так как в таком виде легче
хранить большие количества химерных ДНК. Для создания библи-
отек генов человека особенно удобны векторы, полученные на
основе фага лямбда, такие как EMBL3 или EMBL4. Пакующая
способность этих векторов от 9 до 23 кб, они содержат много
удобных клонирующих сайтов, так что для инсерции ДНК могут
быть использованы разные рестриктазы. Кроме того, эти векто-
ры не содержат последовательностей плазмид, наиболее часто
используемых для клонирования : pBR322 и ColE1. Это позволя-
ет проводить отбор нужных клонов с помощью фаговой ДНК, не
вырезая предварительно инсертированный в нее фрагмент. Для
создания библиотек клонов, содержащих большие районы ДНК,
используется технология искусственных дрожжевых хромосом
-YAC. Последние представляют собой крупные (до 1 млн п.о.)
фрагмены геномной ДНК человека, сшитые с центромерными райо-
нами хромосом дрожжей. После идентификации в таких библиоте-
ках нужных клонов с инсертированными фрагментами чужеродных
ДНК последние могут быть субклонированы в фаговых или
космидных библиотеках.
Скрининг библиотек проводят путем гибридизации на
фильтрах с олигонуклеотидными, кДНК-овыми или любыми иными
ДНК-зондами, а также с помощью антител, если библиотека
сконструирована на основе экспрессионного вектора (рис.1.7).
Для этого химерные фаги, составляющие библиотеку, высевают
на плотно растущий в чашках Петри газон бактерий таким обра-
зом, чтобы образовались отдельные литические бляшки в ре-
зультате инфецирования клеток одним рекомбинантным фагом.
Все культуры дублируют путем отпечатка - реплики, на другие
чашки Петри. Затем на исходные культуры накладывают фильтры
и переносят на них растущие и лизированные колонии, проводят
их разрушение, фиксацию белков и ДНК на фильтре и блот гиб-
ридизацию с меченым ДНК-зондом или иммуноблот с мечеными ан-
тителами (для экспрессионных библиотек). После отмывки филь-
тров от несвязавшихся меченых зондов и радиоавтографии на
рентгеновской пленке проявятся темные пятна в местах локали-
зации колоний, содержащих в инсертированном фрагменте ДНК
последовательности, комплементарные зонду, или специфические
антигены. Отбор положительных колоний фагов на дублированных
культурах производят именно в тех местах, где произошло по-
темнение пленки. Чтобы избежать возможного загрязнения,
отобранные колонии размножают и вновь подвергают скринирова-
нию. Обычно, инсертированную ДНК изолируют из бактериофага и
субклонируют в плазмидном векторе, позволяющем наращивать
большие количества этой ДНК.
1.6 Секвенирование последовательностей ДНК.
Следующими этапами анализа отобранного и клонированного
ДНК фрагмента являются его физическое картирование и опреде-
ление нуклеотидной последовательности, то есть секвенирова-
ние. Методология секвенирования достаточна проста и заключа-
ется в том, чтобы получить серию комплементарных молекул
ДНК, различающихся по длине на одно основание. На практике,
однако, определение нуклеотидной последовательности протя-
женных молекул ДНК представляет собой весьма трудоемкую за-
дачу. Существует два основных метода секвенирования: хими-
ческое - метод Максама-Гильберта и дидезоксисеквенирование -
метод Сэнджера. В первом случае используют химическое
расщепление ДНК по одному основанию, во втором - синтезируют
нужную цепь ДНК in vitro, специфически останавливая синтез
на заданном основании.
Чаще при секвенировании используют метод Сэнджера, так
как он более надежный и простой в исполнении. Принцип данно-
го метода показан на рис.1.8. На первом этапе ДНК денатури-
руют, чтобы получить однонитевые молекулы. Затем добавляют
секвенирующий праймер - искусственно синтезированную олиго-
нуклеотидную последовательность, комплементарную определен-
ному участку исходной молекулы ДНК. Создают условия для гиб-
ридизации праймера, то есть для образования двухцепочечного
участка, и инициируют синтез ДНК, добавляя в реакционную
смесь ДНК-полимеразу и трифосфаты - dATP, dCTP, dGTP и dTTP,
один из которых является радиоактивным. Синтез ведут в четы-
рех параллельных пробирках, в каждую из которых добавляют
один из специфических дидезоксинуклеотидов или терминаторов
- ddATP, ddCTP, ddGTP или ddTTP. При встраивании ddNTP на
место соответствующего нуклеотида синтез ДНК прекращается.
Таким образом, в каждой из пробирок получают набор различаю-
щихся по длине радиоактивномеченых фрагментов ДНК с одним и
тем же специфическим для данной пробирки дидезокситерминато-
ром на конце молекулы. После одновременного электрофорети-
ческого разделения этих фрагментов на четырех соседних до-
рожках и радиоавтографии, размер синтезированных фрагментов
может быть определен, а значит и определена локализация ди-
дезоксинуклеотидов и порядок соответствующих им нуклеотидов
в исходной молекуле ДНК (Рис.1.9). На каждом секвенирующем
геле может быть определена первичная последовательность все-
го около 500 пар оснований. В своем первоначальном варианте
этот метод является достаточно трудоемким и дорогостоящим.
Достаточно заметить, что цена одного звена (шага) в цепи ДНК
в Международной Программе "Геном человека" еще несколько лет
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73