копии гена F8A (Lakich et al.,1993).
Во время процессинга первичного белкового продукта гена
F8C от исходного пептида из 2 351 аминокислотных остатка от-
щепляется последовательность в 335 аминокислотных остатка. В
плазме крови фактор VIII существует в виде металлозависимого
гетеродимера, состоящего из С-концевой легкой цепи (80 кД) и
N-концевой тяжелой цепи (200 кД). Половина всех больных с
гемофилией A не имеют фактора VIII, 5%- имеют нормальное ко-
личество нефункционирующего белка и в остальных случаях ак-
тивность белка сохранена, но его количество резко снижено
(McGinnis et al.,1993).
Изолированные случаи гемофилии A составляют 30%; 70% -
семейные варианты. Показано, что мутации в гене F8 возникают
в сперматогенезе в 3 - 5 раз чаще, чем в оогенезе (Rosendaal
et al., 1990; Brocker-Vriends et al., 1991). Это означает,
что в 80-86% спорадических случаев матери являются носителя-
ми мутации, возникшей в зародышевых клетках их отца. Кроме
того, около 14% матерей, не являющихся носителями мутации,
могут быть соматическими или гонадными мозаиками, так что
вероятность повторного рождения больного ребенка у них также
повышена.
Около 10% всех идентифицированных мутаций в гене F8 яв-
ляются делециями одного или нескольких смежных экзонов. При-
мерно 5% всех мутаций составляют короткие делеции и дуплика-
ции гена, остальные мутации - точковые замены (Antonarakis
et al.,1995). Почти половина миссенс мутаций идентифицирова-
на в домене A2. Показано, что 35% всех известных мутаций ло-
кализовано в CpG динуклеотидах, причем свыше 90% из них
представляют собой C-T или G-A транзиции (Cooper,
Youssoufian, 1988). Подобные мутации в кодирующих районах
встречаются в 42 раза чаще, чем это можно было бы ожидать на
основании случайного характера мутагенеза. Для подавляющего
большинства мутаций гена F8C характерно практически полное
отсутствие "горячих" точек: каждая семья высокого риска по
гемофилии А имеет свою собственную мутацию. Исключение
составляет группа обнаруженных сравнительно недавно протя-
женных инверсий интрона 22, захватывающих экзоны 1-22 и пол-
ностью блокирующих функцию гена. Такие инверсии, как оказа-
лось, присутствуют в 45% семей с тяжелой формой гемофилии А
(Lakich et a.,1993). Причиной инверсий в этой области гена
является гомологичная рекомбинация между идентичными после-
довательностями гена F8А, расположенного в интроне 22
F8C-гена, и другими копиями этого же гена,находящимися на
расстоянии 500 кб от 5'конца гена F8 (см.выше).
Помимо инверсий и точечных мутаций в гене ФVIII заре-
гистрированы несколько случаев инсерционного мутагенеза,
связанных с перемещением в геноме транспазонподобных элемен-
тов типа LINE ( см. Главу II). У двух пациентов неродствен-
ного происхождения был идентифицирован инсертированный в эк-
зоне 14 F8C-гена длинный элемент LINE-1 (L1) (Kazazian et
al.,1988). В обеих семьях это были мутации de novo. L1
последовательности представляют собой специфическое для ге-
нома человека семейство длинных, размером от 2 до 4 кб, пов-
торяющихся элементов, распределенных по всем хромосомам и
состоящее, примерно, из 100 000 копий. Было показано что оба
L1 элемента, инсертированные в F8C-ген, родственны ретрот-
ранспозону, локализованному на хромосоме 22 (Dombroski et
al., 1991). В третьей семье инсертированный в интроне 10
F8C-гена L1 элемент не был связан с болезнью. Все 3 L1 эле-
мента имели открытые рамки считывания, а соответствующие ре-
конструируемые аминокислотные последовательности были высоко
идентичны друг другу с уровнем гомологии, превышающим 98%.
Таким образом, были получены еще одни косвенные подтвержде-
ния существования ряда функциональных L1 элементов, кодирую-
щих 1 или несколько белков, необходимых для их ретротранспо-
зиции.
Прямая диагностика протяженных инверсий в гене F8 осу-
ществляется путем блот-гибридизации с ДНК зондом р482.6 c
последующей рестрикцией эндонуклеазами Bcl1, Dra1, Nco1
(Lakich et al.,1993). В остальных случаях, в силу отсутствия
мажорных мутаций в гене F8C, чаще всего используют косвенные
методы молекулярной диагностики. С помощью ПЦР анализируют
полиморфные динуклеотидные СА-повторы экзона 13, HindIII по-
лиморфизм в интроне 19; HbaI полиморфизм в интроне 22 и вне-
генный полиморфизм локуса DXS52 (St14/TaqI) (Асеев и др.,
1989; Aseev et al., 1994; Сурин и др., 1990).
Учитывая наличие функционально активной формы белка
фактора VIII в плазме крови генноинженерые подходы в терапии
этого заболевания направлены на получение в чистом виде пол-
ноценного белкового продукта (заместительная терапия), либо
на введение в организм больного соответствующей кДНК,
обеспечивающей синтез ФVIII и его поступление в кровь. Осу-
ществленное 10 лет назад выделение и клонирование кДНК этого
гена сделало реальным оба эти подхода. Имеются сообщения о
получении трансгенных животных (коз), в геном которых введен
ген фактора VIII. Они могут быть использованы как продуценты
полноценного белкового продукта. Генная терапия этого забо-
левания находится на стадии экспериментальных разработок
(см.Главу IX). Успешно осуществлена трансдукция фибробластов
человека in vitro с помощью ретровирусного вектора. Основная
проблема в данном направлении заключается в выборе эффектив-
ного промотора и подборе клеток, в которых экспрессия гена
могла быть достаточно длительной. В настоящее время найдены
невирусные промоторы, обеспечивающие эффективную и длитель-
ную экспрессию гена фактора VIII in vivo. В качестве возмож-
ных клеток-мишеней используют мышечные клетки, фибробласты,
гепатоциты и клетки эндотелия сосудов. В 1994г. методом нап-
равленного мутагенеза (см.Главу VIII) получены трансгенные
модели гемофилии А на мышах. Есть все основания считать, что
клинические испытания генокоррекции этого заболевания нач-
нутся уже в ближайшем будущем.
10.4.4 Гемофилия B.
Гемоофилия B - сцепленное с полом заболевание, вызван-
ное наследственным дефектом фактора IX - важного компонента
средней фазы внутреннего каскада свертывания крови. Белок
(фактор IX) - гликопротеин, состоит из 415 аминокислотных
остатков, объединенных в 8 доменов, синтезируется в виде мо-
лекулы-предшественника клетками печени. В плазме крови фак-
тор IX находится в виде гетеродимера, состоящего из 2-х по-
липептидных цепей - легкой (L) и тяжелой (H), ковалентно
связанных между собой одним дисульфидным мостиком. Фактор IX
циркулирует в виде неактивного зимогена до тех пор, пока не
произойдет протеолитическое высвобождение его активирующего
пептида, что позволяет ему принять конформацию активной се-
риновой протеазы. Его роль в свертывании крови связана с ак-
тивацией фактора X посредством взаимодействий с ионами каль-
ция, фосфолипидами мембраны и фактором VIII.
Ген фактора IX транскрибируется в гепатоцитах с образо-
ванием мРНК размером 1 383 п.о. Для гена F9 характерна высо-
кая частота возникновения мутаций - 4.1*10!6 за поколение.
Также как и при гемофилии A мутации значительно чаще возни-
кают в сперматогенезе, чем в оогенезе (Montandon et
al.,1992). Считается, что вероятность получения мутации от
отца в 11 раз выше, чем от матери. Это означает, что в изо-
лированном случае вероятность гетерозиготного носительства
мутации у матери составвляет более 80%. Обнаружена четкая
корреляция между возрастом отца и вероятностью получения от
него новой мутации в гене F9. Так, средний возраст отца в
момент рождения дочери - носительницы новой мутации, состав-
ляет около 42 лет (King et al.,1992).
К 1994 г идентифицировано около 400 мутаций в гене ге-
мофилии B. Подавляющее большинство из них замены нуклеоти-
дов, приводящие к заменам аминокислот или к образованию
стоп-кодонов. Характерно, практически, полное отсутствие вы-
раженных мажорных мутаций и доминирующих областей повышенной
частоты мутирования. Только одна мутация - I397T, встрети-
лась в 7 самьях. Около 42% точечных мутаций возникает в CpG
динуклеотидах (Bottema et al., 1993). Показано, что частота
G-A или C-T транзиций в CpG cайтах в 24 раза выше, чем в
других местах гена (Koeberl et al., 1990). Кроме того, в CpG
динуклеотидах гена F9 в 7.7 раз чаще возникают трансверсии
(A-T, A-C, G-T или G-C). Это обьясняется тем, что содержание
(G+C) в кодирующих областях F9-гена составляет 40% (Bottema
et al., 1991).
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73
