уровнем транскрипции могут быть пригодны дот или слот блоты
(см.Главу I). Когда источником РНК служат клетки, которые не
могут быть получены в большом количестве, используют цитоп-
лазматический дот-блот. При этом целые клетки лизируют, и
фиксируют непосредственно на тех мембранах, на которых про-
водят гибридизацию. Значительно большой чувствительностью
обладает, так называемый Northern blot (нозерн-блот) - гиб-
ридизация с ДНК- зондами на фильтрах предварительно скон-
центрированных и фракционированных путем электрофореза моле-
кул РНК (Sambrook et al., 1987). Электрофорез проводят в
агарозе с добавлением формальдегида, денатурирующего РНК. В
этих условиях скорость продвижения молекул РНК через гель
находится в логарифмической зависимости от длины последова-
тельности, что позволяет точно определить размер РНК
транскрипта. Основная масса РНК на геле представлена в виде
двух доминирующих бэндов, соответствующих двум типам рибосо-
мальной РНК - 28S и 18S. Все молекулы мРНК сконцентрированы
в плохо различимой, слабо окрашенной области геля, в которой
отдельные типы мРНК могут быть выявлены только путем гибри-
дизации с соответствующими ДНК-зондами. Нозерн-блот имеет то
преимущество, что при электрофорезе могут быть разделены мо-
лекулы РНК, дающие перекрестную гибридизацию с ДНК-зондом.
Кроме того, характер электрофоретического разделения позво-
ляет визуально оценить качество изолированной РНК. При очень
низких концентрациях специфических мРНК или в тех случаях,
когда ДНК-зонды дают перекрестную гибридизацию с другими
компонентами (не мРНК), проводят обогащение изолированной
тотальной РНК транслируемыми мРНК путем отбора на колонках
фракций, содержащих поли-A "хвосты". Для этого выделенную
РНК пропускают через короткую колонку с пришитыми поли-T
олигонуклеотидными последовательностями и высокой концентра-
цией солей в буферном растворе, так чтобы молекулы мРНК, со-
держащие поли -A "хвосты", задерживались на колонке. При
снижении концентрации солей в буфере происходит расплавление
A-T дуплексов и высвобождение молекул мРНК. Таким способом
доля этих молекул в определенных солевых фракциях может быть
увеличена на два порядка. Конечно, поли-A селекция применима
в тех случаях, когда имеется достаточно большое количество
тотальной РНК. Другим методом для исследования структуры РНК
транскриптов является S1-анализ. В этом случае ДНК-РНК гиб-
ридизацию ведут в растворе, куда и добавляют S1 нуклеазу для
переваривания однонитевых несвязавшихся молекул как ДНК, так
и РНК, после чего проводят электрофоретическую очистку дуп-
лексов, которые затем элюируют из геля для последующего ана-
лиза (Sambrook et al.,1989). Этот метод очень удобен для
анализа стартовых сайтов и 3'-концов генов, для определения
направления транскрипции и картирования интронов.
Уровень мРНК в клетке определяется несколькими кинети-
ческими параметрами - скоростью первичного синтеза, эффек-
тивностью процессинга РНК-транскриптов и периодом полураспа-
да зрелых молекул мРНК. Последний параметр определяют по ди-
намике исчезновения мРНК после добавления к клеткам актино-
мицина D, специфическим образом супрессирующего транскрип-
цию.
Исследование механизмов транскрипции и процессинга пер-
вичных РНК-транскриптов проводят in vitro с использованием
искусственным образом сконструированных транскрипционных
систем (Manley et al., 1986; Dignam et al., 1983;
Gutierrez-Hartmann et al., 1987; Хэймс,Хиггинс, 1987). Для
этого могут быть выбраны два различных подхода. В первом
случае изолируют ядра и в качестве транскрипционной матрицы
используют неповрежденный хроматин. Синтез РНК проводят с
добавлением всех необходимых реагентов и, в частности, три-
фосфатов, в один из которых (обычно в урацил) вводят ради-
оактивную метку. При этом вновь синтезированные молекулы РНК
оказываются мечеными. Выбор специфических молекул РНК прово-
дят путем ДНК-РНК гибридизации, однако, в отличие от ранее
описанных методов анализа мРНК, используют немеченые
кДНК-зонды, предварительно нанесенные на фильтры. Большим
достоинством этой транскрипционной системы является ее
максимальная приближенность к естественным процессам. При
втором подходе транскрипция ведется с клонированных фрагмен-
тов ДНК, а ядерные экстракты служат источником ферментов и
регуляторных белков.
Раздел 6.3 Анализ трансляции, ДНК-экспрессионные систе-
мы.
Традиционные методы анализа регуляции трансляции и
посттрансляционных модификаций белков основаны на использо-
вании модельных систем, представляющих собой цитоплазмати-
ческие свободные от мРНК безядерные экстракты клеток, содер-
жащие рибосомальный аппарат, транспортные РНК, набор амино-
кислот и ферментов, необходимых для трансляции и процессинга
белков (Хэймс, Хиггинс, 1987; Клеменс, 1987 ). После добав-
ления к такой системе специфической мРНК происходит синтез
соответствующей полипептидной цепи in vitro. При введении
меченых аминокислот в систему вновь синтезированные белки
после электрофоретической очистки могут быть идентифицирова-
ны путем радиоавтографии либо иммунологическими методами,
при наличии соответствующих антител (Клеменс, 1987). Однако,
для значительного числа моногенных наследственных заболева-
ний первичный биохимический дефект неизвестен, а следова-
тельно, не идентифицированы и мРНК транскрипты. Биохими-
ческое изучение многих белков затруднено из-за их минорного
содержания и отсутствия эффективных методов выделения и
очистки. Последнее обстоятельство в значительной мере от-
носится к нерасворимым белкам, ассоциированным с мембранными
структурами клеток.
ДНК-экспрессионные системы, то есть клеточные культу-
ры, синтезирующие чужеродные белки, являются очень мощным
средством анализа структуры, функции и синтеза белков
(Sambrook et al., 1989). Такие системы конструируют на осно-
ве экспрессионных векторов, содержащих в своем составе силь-
ные промоторы и регуляторные последовательности, обеспечива-
ющие высокий, но в то же время регулируемый уровень
экспрессии. Кодирующие последовательности чужеродных генов
инсертируют (вставляют) с помощью соответствующих генно-ин-
женерных приемов в область действия этих промоторов. Конеч-
но, такие системы должны содержать и трансляционные сигналы,
в частности, сайты связывания рибосом, обеспечивающие работу
рибосомального аппарата клеток хозяина. В некоторых случаях
экспрессионные векторы вводят в мутантные по протеазным ге-
нам клеточные культуры, с тем чтобы предотвратить деградацию
чужеродных белков в клетках.
Существует три типа экспрессионных систем - бактериаль-
ные, сконструированные обычно на основе E.coli, дрожжевые и
экспрессионные культуры клеток млекопитающих. Каждая из этих
систем имеет свои преимущества и недостатки. Бактериальные
системы наиболее удобны для клонирования, обладают высоким
уровнем экспрессии (до 1-2 грамм белка на литр культуры) и
их используют, обычно, для производства большого количества
чистого белка, необходимого для получения антител или для
фармацевтических целей. Удобны также эти системы для введе-
ния изменений в различные районы полипептидной цепи путем
сайт-направленного мутагенеза в нуклеотидной последователь-
ности чужеродной ДНК. Получение и исследование таких "му-
тантных" белков очень важно для оценки функциональной значи-
мости различных участков белка.
Уровень экспрессии чужеродных белков в дрожжевых клет-
ках вдвое, а в клетках млекопитающих в десятки раз ниже, чем
в бактериальных. Однако, в бактериальных клетках отсутствуют
ферментативные системы, обеспечивающие процессинг эукариоти-
ческих белков. Поэтому эукариотические системы удобнее
использовать для изучения посттрансляционных модификаций
белка - гликозилирования, то есть присоединения к полипеп-
тидной цепи углеводных остатков; скручивания белка с образо-
ванием третичной структуры, часто, за счет возникновения
дисульфидных связей; и N-концевых модификаций, стабилизирую-
щих структуру белка. В ДНК-экспрессионных системах может
быть синтезировано достаточно много белка, чтобы получить
его в кристаллической форме и исследовать пространственную
структуру и функциональное назначение отдельных доменов
(Хэймс, Хиггинс, 1987).
Использование экспрессионных библиотек для изоляции ко-
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73
