помещали на 16-20 ч в холодильник. На следующий день сыворотку отсасывали в

стерильную центрифужную пробирку, центрифугировали 15-20 мин при 3000

об/мин.

Пробы молозива и молока после взятия выдерживали 16-20 ч при 4° С и

центрифугировали в течение 1 ч при 6000 об/мин. Затем снимали верхний слой

жира, отсасывали надосадочную жидкость, которую и использовали для

определения.

Пластинки из 3 %-ного агара «Дифко», смешанного с антисывороткой

готовили следующим образом: 360 мг агара помещали в колбу, заливали 12 мл

буфера и прибавляли 0,25 мл 1 %-ного раствора мертиолата. Колбу помещали в

баню с холодной водой, которую затем нагревали до кипения и выдерживали

смесь до полного расплавления агара.

После расплавления гель охлаждали до 56° С и к нему приливали равный

объем антисыворотки в рабочем разведении и снова нагревали до температуры

56° С. Смесь тщательно перемешивали и выливали на стекло, помещенное на

столике с уровнем в строго горизонтальном положении.

После застывания геля в нем делали лунки диаметром 2 мм на расстоянии 15

мм друг от друга.

При определении содержания иммуноглобулина G пробы сыворотки крови

разводили буфером рН 8,0 в 20 и 30 раз. Пробы молозива первого дня лактации

в 100, 50 и 20 раз, пробы молозива последующих дней лактации — в 50, 20 и

10 раз, использовали не разведенные и разведенные в 10 раз пробы молока.

При определении содержания иммуноглобулина М пробы сыворотки крови и

молозива разводили в 10 и 5 раз, пробы молока использовали не разведенными

и разведенными в 5 раз.

При определении содержания иммуноглобулина А пробы сыворотки крови

использовали не разведенными, пробы молозива и молока — не разведенными и

разведенными в 5 и 2 раза.

Пробы сыворотки крови получали от новорожденных телят до приема молозива

во всех случаях использовали не разведенными.

Подготовленные пробы крови, молозива, и молока вносили в лунки геля с

антисывороткой с помощью пастеровской пипетки. При этом лунку заполняли

полностью, не переливая пробы за ее пределы.

Параллельно с опытными пробами на каждом стекле ставили контроль —

разливали в лунки стандартный препарат определенного иммуноглобулина. При

этом его разводили буферным раствором с таким расчетом, чтобы в 1 мл

раствора препарата содержалось 5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мл белка.

Таким образом, на каждом стекле получалось 6 лунок с контрольной пробой

препарата.

После заполнения лунок, стекла помешали в эксикатор с водой и

выдерживали при комнатной температуре, при определении содержания

иммуноглобулинов G и А в течение 24 ч, а при определении иммуноглобулина М

— 48 ч.

По окончании сроков инкубации стекла извлекали из эксикатора и измеряли

диаметр кольца преципитата вокруг лунок с помощью линейки Беринг-Верке,

после окрашивания агаровых пластин. С этой целью стекла с агаром погружали

на двое суток в буфер. В течение этого срока буфер трижды заменяли новой

порцией. После отмывания от не участвующих в реакции веществ, пластинки

агара высушивали при комнатной температуре под фильтровальной бумагой.

Затем пластинки (без фильтровальной бумаги) помещали в 0,1 %-ный раствор

амидо-черного 10В на 3 ч, промывали трехкратно раствором уксусной кислоты и

высушивали.

Для приготовления 0,1 %-ного раствора амидо-черного 10В, брали 1 г

краски, растворяли в 100 мл ледяной уксусной кислоты (СН3СООН), после чего

объем раствора доводили дистиллированной водой до 1 л. Раствор хранили в

темной посуде при комнатной температуре. Раствор уксусной кислоты для

промывания: брали 70 мл ледяной уксусной кислоты и доводили объем

дистиллированной водой до 1 л.

Для расчета содержания иммуноглобулинов в испытываемых пробах строили

калибровочную кривую на полулогарифмической бумаге: на оси ординат

откладывали концентрацию белка в пробах стандарта, по оси абсцисс — диаметр

кольца преципитации. Калибровочную кривую строили отдельно по каждому

иммуноглобулину определенного класса.

Количество иммуноглобулина в испытуемой пробе определяли путем сравнения

диаметра кольца преципитации вокруг ее лунки с калибровочной кривой [G.

Mancini, A. O. Carbonara and J.F. Heremans, 1965; У. Дж. Герберт, 1974; В.

М. Чекишев, 1977; П. А. Емельяненко, О. И. Грызлова, Г. Н. Печникова и М.

Н. Тулупова, 1980; P. В. Петров, 1987; Н. С. Жосан, 1989; Н. В. Матузенко,

Е. В. Андреев, А. И. Собко, 1990].

2.1.13. Экспресс-метод для определения содержания иммунных глобулинов.

Кровь получали от телят из яремной вены до приема молозива и через 24 ч

после рождения. Сначала ее выдерживали около часа в (30-35° С), а затем в

холодильнике 10-12 ч. После чего отделяли сыворотку в отдельные пробирки.

Раствор цинк сульфата (208 мг/л ZnSO4Ч7H2O) готовили в мерной колбе на

дистиллированной воде, которую выдерживали 4-5 дней и затем кипятили в

течение 10-15 мин с целью растворения диоксида углерода.

Для приготовления стандарта мутности брали 3 мл раствора хлорида бария

(BaCl2Ч2H2O) в 100 мл дистиллированной воды, вносили в мерную колбу на 100

мл и доводили до метки 0,2N раствором серной кислоты. Полученный раствор

соответствует 20 ед. цинк сульфатному тесту [A. D. MсEwan, E. W. Fisher, I.

E. Selman and W. J. Penhale, 1970].

Калибровочную таблицу для калориметрического определения содержания

иммуноглобулинов на ФЭК-56М получали путем разведения стандарта мутности.

Для определения иммунных глобулинов подбирали пробирки одинакового

диаметра и наливали в каждую по 6 мл цинк сульфатного раствора, а в

контрольною пробирку — 6 мл дистиллированной воды. Во все опытные пробирки

(по количеству образцов) и в контрольную добавляли по 0,1 мл исследуемой

сыворотки и выдерживали при комнатной температуре (20° С) 60 мин. После

экспозиции пробирки взбалтывали, чтобы обеспечить одинаковое

перераспределение осадка и помещали в фотоэлектроколориметр, который

предварительно устанавливали на «0» по дистиллированной воде. Измерение

проводили на ФЭК-56М, ври длине волны 400±5 нм (синий светофильтр) в

кюветах толщиной слоя 10 мм. Показание прибора ФЭК-56М определяли образцах

сыворотки через контрольную пробирку умножением различия на фактор 10. 20

единиц цинк сульфатного теста помутнения были эквивалентны соответственно

20-30 мг/мл содержания колостральных иммунных глобулинов в сыворотке крови

теленка [A. D. MсEwan, E. W. Fisher, I. E. Selman and W. J. Penhale, 1970].

2.1.14. Определение уровня пассивной защиты у новорожденных телят. Метод

основан на том, что белки сыворотки крови могут преципитироваться

различными солями, включая сульфит натрия (Na2SO3). Этот феномен зависит от

концентрации соли и молекулярной характеристики белков. Готовили 14-, 16-,

и 18 %-ный растворы Na2SO3, используя для этих целей безводный реактив.

Соответственно 14, 16 и 18 г его растворяли в 100 мл дистиллированной воды.

Кроме безводного сульфита натрия использовали Na2SO3Ч7Н2О, при этом

количество его для приготовления соответствующих концентраций увеличивали

вдвое.

В пробирки вносили по 1,9 мл раствора сульфита натрия каждой

концентрации и добавляли по 0,1 мл испытуемой сыворотки. Пробирки тщательно

встряхивали и выдерживали 1 ч при комнатной температуре. Реакцию считали

отрицательной, если преципитат не образуется и положительной, если видны

хлопья преципитированного белка или заметно даже небольшое его присутствие,

в данном случае уровень иммуноглобулинов в испытуемой сыворотке

соответствует промежуточному значению. Концентрация иммуноглобулина меньше

5 мг/мл соответствовала помутнению при концентрации 18 %; от 5 до 15 мг/мл

— 16 и 18 %, и больше 15 мг/мл — 14, 16 и 18 % сульфита натрия. [N. E.

Pfeiffer, T. C. McGuire, 1977; N. E. Pfeiffer, T. C. McGuire, R. E. Bendel

and J. M Weikel, 1977; Ю. Н. Федоров, 1988].

Сывороточный гемолиз не влиял на результаты преципитации

иммуноглобулинов.

2.1.15. Выделение лактоглобулина из колостральной сыворотки.

Лактоглобулины из сыворотки молозива получали солевым методом. За основу

взяли методику фракционного высаливания противогриппозных сывороток.

К сыворотке добавляли два или три объема дистиллированной воды в

зависимости от содержания белка. В смесь, при перемешивании мешалкой,

добавляли тонкой струей насыщенный раствор сернокислого аммония. После

тщательного перемешивания смесь оставляли в покое на 10-15 ч в холодильнике

до полного формирования осадка.

Лактоглобулин сыворотки молозива подвергался высаливанию 38 объемными

процентами насыщенного раствора сернокислого аммония по формуле:

Х=[pic],

где: Х — объем насыщенного раствора сернокислого аммония;

С — требуемая концентрация сернокислого аммония;

Y — объем разбавленной молозивной сыворотки.

рН насыщенного раствора сернокислого аммония — 7,3-7,5.

Выпавший осадок лактоглобулина отделяли от раствора путем фильтрации

через воронку Бюхнера с двойным слоем хроматографической бумаги.

Плотный осадок переносили в целлофановые мешочки и подвергали диализу в

проточной водопроводной воде, а затем в дистиллированной воде до тех пор,

пока в растворе не обнаруживалось даже следов сернокислого аммония, что

проверяли реактивом Несслера.

По окончании диализа определяли концентрацию белка (рефрактометрически)

в растворе лактоглобулина и дистиллированной воды разбавляли его до

содержания 10 % белка. К раствору добавляли хлорид натрия до изотонического

насыщения.

Подученный препарат подвергали стерилизующей фильтрации через фильтр

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20