каждые 1000 мл молозива или молока добавляли 100 мл 0,5% раствора пепсина и

после тщательного перемешивания смесь помещали в водяную баню при

температуре 38° С на четыре часа. Образовавшийся сгусток, отделяли от

сыворотки фильтрацией через три слоя марли. Полученную сыворотку пропускам

через воронку Бюхнера с двойным слоем бедой фильтровальной бумаги, а затем

через бактериальный фильтр Зейтца.

2.1.5. Реакция атглютинации с молозивной и молочной сыворотками. В

центрифужные пробирки наливали 5-6 капель 5 % раствора пепсина,

приготовленного на изотоническом растворе хлорида натрия и 10 мл

исследуемого молозива или молока, тщательно перемешивали и для свертывания

ставили в термостат при температуре 38°С на 30 мин. Свернувшееся молозиво

отделяли от стенок пробирки стеклянной палочкой и центрифугировали при 3000

об/мин в течение 30 мин.

С полученной сывороткой ставили реакцию агглютинации в объеме 1 мл в

разведениях с физиологическим раствором от 1:10 до предельного титра

сыворотки. Контроли обычные.

Антиген добавляли по 0,05 мл в каждую пробирку, пробы встряхивали и

помешали в термостат при температуре 37°С на 4 ч, после чего производили

предварительный учет реакции, а окончательный учет реакции определяли через

24 ч. Молозиво исследовали в день его получения.

2.1.6. Определение титра агглютининов. Для изучения динамики накопления

агглютининов в сыворотках крови и молозива использовали реакцию

агглютинации, которую ставили в объеме 1 мл (классическим методом) в

пробирках с ровным округлым дном с убитыми и живыми О- и К-антигенами

(серотипы О78:К80; О119:К69; О137:К79 Е. coli ).

Для определения агглютинационных титров, в наших исследованиях применяли

двукратное разведение сывороток. Разведение сывороток крови и молозива

производили в агглютинационных пробирках начиная с разведения 1:10.

После добавления антигена (по 0,05 мл) содержимое пробирок встряхивали,

затем помещали в термостат на 4 ч при температуре 37°С. После этого

производили предварительный учет результатов реакции. В дальнейшем пробирки

выдерживали 24 ч при комнатной температуре и определяли окончательный

результат.

Для учета результатов реакции агглютинации пользовались четырех

крестовой системой обозначения. За агглютинационный титр принимали то

наибольшее разведение сывороток, при котором еще наблюдалась видимая

агглютинация, оцениваемая в четыре креста.

2.1.7. Определение активности лизоцима в сыворотке крови. Сыворотку

крови, отделяли общепринятым методом. Предварительно готовили 1/15М

фосфатный буфер (рН 6,2), для чего использовали два исходных раствора:

4,539 г х. ч. КН2РО4 растворенный в 500 мл дистиллированной воды и 2,375 г

х. ч. Nа2НРО4Ч12Н2O, растворенный в 200 мл дистиллированной воды. При

смешивании этих растворов в определенном соотношении, получали рН буфера

6,2.

Для приготовления 1 % агара «Дифко» на 1/15М фосфатном буфере брали 1 г

сухого агара, помещали в колбу на 200 мл и заливали 99 мл 1/15М фосфатного

буфера. Колбу закрывали ватно-марлевой пробкой, помещали в кипящую баню и

выдерживали 25-30 мин.

Расплавленный агар охлаждали до 60-70°С и вносили в него ацетоновый

порошок Micrococcus lysodeikticus из расчета 10-20 мг на 100 мл объема.

Необходимое количество порошка перед внесением в агар суспендировали в 3-5

мл 1/15М фосфатного буфера. Полученную смесь перемешивали до получения

однородной взвеси.

Полученную смесь разливали в чашки Петри с таким расчетом, чтобы

подучить толщину слоя 4 мм.

После застывания агара в нем при помощи тонкостенной трубочки вырезали

лунки диаметром 5 мм на расстоянии 2-3 см от краев чашки и друг от друга.

Для подсыхания лунок чашки помещали в термостат приоткрытыми на 60 мин.

Исследуемые пробы сыворотки крови разводили соответственно 1/15М фосфатным

буфером 1:10, 1:2 и 1:5. Каждую пробу после разведения заливали в отдельную

лунку в объеме 0,05 мл.

Параллельно с исследуемым материалом 1/15М фосфатным буфером разводили

стандартный кристаллический лизоцим так, чтобы получить его растворы с

концентрацией 0,5 мкг/мл, 1; 3; 5; 10; 20; 40; 60; 80 и 100 мкг/мл. По 0,05

каждого разведения стандартного лизоцима разливали по отдельным лункам.

Чашки Петри с исследуемым материалом и стандартным лизоцимом выдерживали

48 ч во влажной камере при комнатной температуре (22-24°С).

После экспозиции при помощи линейки измеряли диаметр зон лизиса

Micrococcus lysodeikticus вокруг лунок с исследуемым материалом и

стандартным лизоцимом.

Первоначально на полулогарифмической бумаге строили калибровочную

кривую, используя результаты, полученные при измерении зон лизиса вокруг

лунок с раствором стандартного лизоцима в различных концентрациях. Для

этого значения, отражающих диаметры зон лизиса субстрата в миллиметрах,

откладывали по оси абсцисс, а показатели концентрации стандартного лизоцима

в мкг/мл, вызывающих лизис по оси ординат. Точки пересечения первых и

вторых значений соединяли между собой, при этом получалась прямая линия.

Расчет результатов проводили следующим образом. Диаметр зоны лизиса

Micrococcus lysodeikticus вокруг лунки с сывороткой крови составил 9,5 мм.

На калибровочном графике этому значению соответствовала концентрация 2,5

мкг/мл стандартного лизоцима. Сыворотку крови перед исследованием разводили

1:10 1/15М фосфатным буфером. Следовательно, концентрация лизоцима в

исследуемой пробе сыворотки крови равнялась 2,5Ч10=25 мкг/мл. Так как,

литическая активность стандартного лизоцима изменяется в результате

изготовления и хранения, полученное абсолютное значение выражали в единицах

относительной активности. Активность стандартного лизоцима составляла 20600

ед/мг или 20,6 ед/мк, активность лизоцима исследуемой пробы сыворотки

молозива равнялась 20,6Ч25 =515,0 ед/мл.

2.1.8. Определение содержания комплемента в сыворотке крови.

Исследовали сыворотку крови, полученную из яремной вены животных.

Предварительно готовили веронал-мединаловый буфер: 0,575 г веронала

растворяли в 50 мл дистиллированной воды, подогретой до 60° С, охлаждали и

добавляли 8,5 г хлорида натрия, 0,375 г мединала, 0,5 мл раствора

содержащего 1 М MgCl2 и 0,3 М CaCl2 (100 мл Н2О + 19 г MgCl2Ч6Н2О г + 6 г

CaCl2). Объем доводили до 200 мл дистиллированной водой. Буфер хранили в

холодильнике. Перед употреблением буфер разводили дистиллированной водой

(1:4). Физиологический раствор: 8,5 г хлорида натрия растворяли в 1 л

дистиллированной воды и фильтровали.

Эритроциты барана. Кровь у барана брали из яремной вены в колбу с бусами

и встряхивали в течение 10-15 мин для предотвращения свертывания.

Дефибринированную кровь фильтровали через двойной слой марли. Эритроциты

барана отмывали 3 раза центрифугированием по 10 мин при 3000 об/мин. Из

отмытых эритроцитов готовили 5 % взвесь на физиологическом растворе и

стандартизовали на ФЭК. С этой целью эритроциты лизировали: к 1 мл отмытых

эритроцитов добавляли 9 мл дистиллированной воды. Лизированные эритроциты

фотоколориметрировали при зеленом светофильтре против воды. Оптическая

плотность лизата — 1,08 при длине 541 мкм в кювете 10 мм.

Для определения титра гемолизина, готовили вначале основное разведение

гемолитической сыворотки 1:100 (0,1 мл сыворотки + 9,9 мл буфера), затем из

этого разведения поучали разведения от 1:1000 до 1:4000.

| |1:1000 |1:1200 |1:1500 |1:2000 |1:2500 |1:3000 |1:3500 |1:4000 |

|Буфер, мл |0,9 |1,1 |1. 4 |1,9 |2,4 |2,9 |3,4 |3,9 |

|Гемолизин |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |

Гемолитическую систему готовили следующим образом. К стандартизованной 5

% взвеси эритроцитов барана медленно, при постоянном помешивании, добавляли

равный объем гемолизина в тройном титре. Так, если полный гемолиз

наблюдался в пробирке с разведением гемолитической сыворотки 1:1200, то для

приготовления гемолитической системы брали разведение 1:400 (0,1 мл цельной

гемолитической сыворотки и 39,9 мл буфера). Пробирки с гемолитической

системой встряхивали и инкубировали при 37° С в течение 1ч для

сенсибилизации эритроцитов барана.

Исследуемую сыворотку, разводили 1:10, разливали в 10 пробирок и

доводили буферным раствором (физиологическим) до 1,0 мл. После этого в

каждую пробирку добавляли 1 мл гемолитической системы, то есть

сенсибилизированных эритроцитов барана, 2-я пробирка — контрольная.

|Исследуемая сыворотка|0,05|0,1 |0,15|0,2 |0,25|0,3 |0,35|0,4 |0,45|0,5 |

|(1:10), мл | | | | | | | | | | |

|Буферный раствор |0,95|0,9 |0,85|0,8 |0,75|0,7 |0,65|0,6 |0,55|0,5 |

|Сенсибилизированные |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |

|эритроциты барана | | | | | | | | | | |

Пробирки инкубировали при 37° С в течение 45 мин, охлаждали в

холодильнике 10 мин, центрифугировали при 1500 об/мин и колориметрировали

на ФЭК в кюветах (10мм) с зеленым светофильтром против воды и определяли

процент гемолиза.

Для определения активности комплимента в гемолитических единицах

готовили шкалу и кривую гемолиза. Для приготовления шкалы гемолиза к 1 мл

стандартной 5 % взвеси эритроцитов барана прибавляли 3 мл дистиллированной

воды в результате чего происходил гипотонический лизис эритроцитов (100 %

гемолиз). Пробирку центрифугировали (при 1500 об/мин 10 мин) и готовили

шкалу гемолиза:

|100 % гемолиз эритроцитов|0,1 |0,2 |0,3 |0,4 |0,5 |0,6 |0,7 |0,8 |0,9 |1,0 |

|на дистиллированной воде | | | | | | | | | | |

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20