|Буферный раствор, мл |0,9 |0,8 |0,7 |0,6 |0,5 |0,4 |0,3 |0,2 |0,1 |0 |

|Гемолиз, % |10 |20 |30 |40 |50 |60 |70 |80 |90 |100 |

Полученные разведения и исходный раствор колориметрировали на ФЭК в

кюветах (1 мм) и строили график зависимости коэффициентов экстинции от

процента гемолиза. На оси абсцисс откладывали процент гемолиза, на оси

ординат — показатели экстинции, соответствующие данному проценту гемолиза.

Расчет 50 % гемолитических единиц комплемента в 1 мл проводили следующим

образом. После титрования исследуемой сыворотки, инкубации ее при 37° С в

течение 45 мин, выдержки в течение 10 мин в холодильнике при 4° С и

центрифугирования пробирку из шкалы гемолиза с одной 50 % единицей

комплемента (№5) сравнивали с пробирками из ряда титрования сыворотки. Если

содержимое пробирки №5 соответствовало по цвету пробирке №6, из ряда

титрования комплемента исследуемой сывороткой, то есть дозе комплемента 0,3

мл, то расчет вели следующим образом.

0,3 мл сыворотки (разведение 1:10) соответствует одной 50 %

гемолитической единице комплемента, а в 1 мл исследуемой сыворотки

содержится:

0,3 мл (1:10) — 1

1,0 мл — Х

Х =[pic] = 3,33 ел/мл.

2.1.9. Определение содержания пропердина в сыворотке крови. Для

определения титра пропердина исследуемую сыворотку разводили мединал-

вероналовым буфером (рН 7,2-7,4), начиная с 1:10 до 1:320. В центрифужные

пробирки вносили по 0,2 мл каждого разведения сыворотки, до 0,2 мл

суспензии инулина (соответствует 3 мг сухого вещества) и по 0,2 мл

комплемента в рабочем титре. В контрольный ряд пробирок вместо инулина

добавляли по 0,2 мл буфера. Все пробы (опытные и контрольные) помещали на 1

ч в термостат при 37° С, после чего центрифугировали, переносили

супернатант в отдельные пробирки по 0,3 мл и добавляли по 0,2 мл

стандартной гемолитической системы. Реакцию учитывали после 20-минутной

экспозиции при 37° С. За титр пропердина принимали то наибольшее разведение

сыворотки, в котором наблюдается полная задержка гемолиза, и в каком

разведении в контрольном ряду отличается полный гемолиз. Данные

рассчитывали по формуле:

|Разведение, в котором отмечен|— |Разведение, в котором отмечена |Ч10 |

|полный гемолиз в контроле | |полная задержка гемолиза в опыте| |

|Разведение, в котором отмечен полный гемолиз в контроле |

Полученные результаты выражали в ед/мл. При полной задержки гемолиза в

разведении 1:35 в опыте, а в контроле — полный гемолиз в разведении 1:50,

содержание пропердина в 1 мл испытуемой сыворотки составляет:

[pic]Ч10 = 3 ед/мл.

Тестированные показатели: комплементарную, лизоцимную, пропердиновую

активность, а также содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови, молоке и

молозиве крупного рогатого скота определяли по методам В. Г. Дорофейчук,

1968; X. Я. Грант, Л. И. Яворский, И. А. Блумберг, 1973; И. М.

Архангельский, 1976; В. Н. Андреев, Г. И. Подопригора, 1977; Е. С.

Фортинская, А. М. Наумова, Е. А. Маркова, 1977; О. Н. Грызлова, П. А.

Емельяненко, В. Н. Денисенко, 1978; Э. Бем, 1979; П. А. Емельяненко, О. И.

Грызлова, Г. Н. Печникова и М. Н. Тулупова, 1980; Э. С. Коган, 1981; Г. В.

Павлов, Г. Н. Печникова, Смолянская- О. О. Суворова, 1988; В. В.

Биктимиров, 1993.

При определении лизоцима, учитывая замедленную активность фермента

крупного рогатого скота, приводили тщательную подготовку материалов к

исследованию, чтобы избежать ошибок, связанные с действием на тест-микробы

других литических факторов исследуемой пробы.

При тестировании комплементарной активности сыворотки крови тщательно

осуществляли подбор индикаторной системы чувствительной к комплементу

крупного рогатого скота.

Для определения пропердина использовали модифицированный метод

предложенный П. А. Емельяненко и др., 1980.

2.1.10. Изучение бактерицидной активности сывороток крови. Для

определения бактериостатической и бактерицидной активности сывороток крови

О. В. Смирнова, Т. А. Кузьмина (1966) предложили фотонефелометрический

метод.

В нашей работе мы учитывали изменения оптической плотности питательной

среды с микробами и питательной среды с испытуемой сывороткой крови и

микробами сразу после соединения и через 3-, 5-, 7-, 9-, 12- и 24-часовой

инкубации.

Для нефелометрического метода чистую культуру Е. coli высевали на МПА и

выращивали в термостате при температуре 37° С в течение 24 ч. Затем смывали

стерильным изотоническим раствором хлористого натрия и стандартизовали до

содержания в 1 мл 2 млрд. микробных тел. Из этой взвеси производили посев

на МПБ в пробирки и сутки выращивали в термостате при вышеуказанной

температуре.

Для определения бактерицидной активности сывороток крови мы использовали

питательную среду (обогащенный пептоном бульон Хоттингера), содержащую 200

мг% амминного азота.

В стерильные кюветы с рабочей длиной 10 мм стерильной пипеткой разливали

по 4,5 мл бульона Хоттингера, затем добавляли по 0,5 мл испытуемой

сыворотки крови и суточную бульонную культуру Е. coli по одной

бактериологической петле (диаметр петли 4 мм).

Контрольные кюветы заполняли теми же компонентами, что и опытные с той

лишь разницей, что в один кювет вместо сыворотки добавили 0,5 мл

стерильного изотонического раствора хлорида натрия. Содержимое всех кювет

тщательно перемешивали стерильной стеклянной палочкой, после чего все

кюветы закрывали ватно-марлевыми пробками. Оптическую плотность среды

определяли на фотоэлектроколориметре ФЭК-М, используя зеленый светофильтр.

После этого кюветы ставили в термостат при температуре 37° С. Повторно

определяли оптическую плотность содержимого кювет через 3, 5, 7, 9, 12 и 24

ч. Установку «0» на ФЭК-е производили с помощью кюветы, заполненной

дистиллированной водой. Оценку бактерицидной активности сыворотки крови

проводили по формуле:

А=100- [pic]Ч100,

Где: А — бактерицидная активность (в %);

Д — оптическая плотность;

Т — время экспозиции кювет в термостате (в часах).

Затем вычисляли среднюю «напряженность бактерицидной активности» (НБА)

по формуле:

Средняя НБА = [pic],

Где: НБА — средняя напряженность бактерицидной активности молозивной

сыворотки;

А1, А2, А3.....Аn — бактерицидная активность сыворотки молозива через 3,

5, 7, 9, 12 и 24ч (в %);

Т1, Т2, Т3....... Тn — продолжительность термостатирования (в часах).

2.1.11. Постановка опсонофагоцитарной реакции. При постановке

опсонофагоцитарной реакции руководствовались методикой, описанной В. Я.

Мозгис (1982). Для приготовления антигена культуру Е. coli выдерживали в

термостате при температуре 37° С в течение 18-24 ч в МПБ, а затем на МПА в

течение 24 ч. Проверяли на чистоту и смывали стерильным изотоническим

раствором хлорида натрия. По оптическому стандарту доводили концентрацию до

2-х млрд. микробных тел в 1 мл. Приготовленную взвесь нагревали в водяной

бане при 70° С в течение 30 мин.

Для опсонофагоцитарной реакции применяли только суточную агаровую

культуру Е. coli.

Исследования проводили в следующей последовательности. В пронумерованные

стерильные пробирки наливали до 0,5 мл 2 % прокипяченного и охлажденного

раствора лимоннокислого натрия, 1 мл крови от исследуемых телят и тщательно

смешивали, сюда же вносили по 0,5 мл антигена. После осторожного

перемешивания пробирки помещали в термостат при 38° С на 3 мин,

предварительно погрузив их на 2-3 мин в водяную баню с температурой 38° С.

Затем пробирки из термостата извлекали, готовили мазки, сушили на воздухе,

нумеровали, фиксировали в метиловом спирте в течение 5 мин и окрашивали по

Романовскому-Гимза.

Для приготовления рабочего раствора краски, дистиллированную воду

усредняли фосфатными буферами: 1. Двухосновной фосфат натрия

(Na2HPO4Ч12H2O) — 17,814 г на 1 л (рН 8,302). 2. Одноосновной фосфат калия

(KH2PO4) — 13,638 г на 1 л (рН 4,529). Если к литру дистиллированной воды

прибааляли по 5 см3 того и другого раствора, то рН такой воды был равен

6,813.

Краску готовили ex tempore из расчета 1,5 капли краски на 1 мл

усредненной воды с рН 6,813. Мазки окрашивали в течение 45 мин, промывали

водопроводной водой и высушивали на воздухе. Окрашенные мазки исследовали

под иммерсионной системой микроскопа и окуляра 7Ч.

Подсчет фагоцитированных микробов производили в 100 нейтрофилах. На

основе подсчета определяли фагоцитарную интенсивность (среднее число

поглощенных микробов одним нейтрофилом) и фагоцитарную активность (процент

фагоцитирующих нейтрофилов). С кровью подопытных животных поставили 450

реакций.

2.1.12. Определение содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови,

молозиве и молоке крупного рогатого скота.

Предварительно готовили фосфатный буфер 0,03М, рН 3,0. С этой целью 10,74 г

натрия фосфорнокислого двух замещенного (Na2HPO4Ч12H2O) и 5,84 г хлорида

натрия помещали в мерную колбу, растворяли в дистиллированной воде и

доводили объем до 1 л. Подобным образом готовили раствор из 4,08 г

однозамещенного фосфорнокислого калия (KH2PO4) и 5,84 г хлорида натрия.

Растворы под контролем потенциометра смешивали в соотношении

обеспечивающим рН буфера 8,0.

Пробы сывороток крови получали путем выдержки взятой крови из яремной

вены животных 20-30 мин при 37° С в термостате. После отделения

образовавшегося сгустка от стенок пробирок стеклянной палочкой, кровь

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20