обнаружены также между тремя последовательностями С-генов. С-сегмент клона
В1 отличается от полного С-сегмента клона С2 по 9 позициям, из которых 5
ведут к замене аминокислоты. По-видимому, эти последовательсти также
представляют собой разные зародышевые гены.
Анализ структурной организации локуса с помощью Саузерн блот-
гибридизации указывает, что у стерляди имеются множественные VL гены.
Точная оценка их количества невозможна, но наличие более 20 полос
гибридизации с разной интенсивностью сигнала, по аналогии с многочисленными
литературными данными, позволяет говорить о нескольких десятках копий.
При использовании С-зонда количество полос в мягких условиях
гибридизации не превышает 4-х. Учитывая возможность аллелизма можно
говорить о наличии в этом локусе 2-4х генов.
Ярко выраженное количественное превосходство V генов над С-генами
является характерным признаком сегментарной формы организации локуса. У
хрящевых и костистых рыб с кластерной организацией генов L-цепей количество
V и С генов очень велико и приблизительно одинаково, что отражается в
сходной картине блот-гибридизации. Полученные нами результаты являются
серьезным основанием для того, чтобы утверждать, что у стерляди организация
генов L-цепей каппа-подобного типа имеет сегментарный характер, подобный
организации каппа локуса млекопитающих.
Эти данные указывают на то, что переход от кластерной к сегментарной
организации произошел в филогенезе позвоночных очень рано, возможно уже у
древних первично-костных.
ВЫВОДЫ
1. Сконструирована библиотека кДНК лейкоцитов стерляди
представительностью 6х106 независимых клонов. ПЦР ДНК библиотеки с помощью
вырожденного праймера, соотвествующего J сегменту генов ИГ, позволил
выявить фрагмент ДНК длиной 370 пн, гомологичный V генам ИГ позвоночных.
2. Из библиотеки кДНК с использованием продукта ПЦР в качестве зонда
выделено пять клонов, содержащих вставки кДНК генов L-цепей ИГ.
Сравнительный анализ первичной структуры кДНК клонов показал, что они
являются членами одного семейства генов и имеют наибольшее сходство с
генами каппа типа.
3. Согласно результам геномного блот-анализа идентифицированное
семейство содержит несколько десятков V генов и только 2-4 С гена, что
указывает на сегментарную форму его организации.
4. Полученные данные указывают что переход от кластерного типа
организации генов ИГ, характерного для хрящевых рыб, к сегментарному,
присутствующему у всех млекопитающих, произошел в эволюции в период
появления первично-костных рыб.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Мазин А. В., Кузнеделов К. Д. и др. Методы молекулярной генетики и
генной инженерии. Новосибирск, 1988. 333 с.
Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование. М.: Мир,
1984. 480 с.
Пол У. (ред.) Иммунология. М.: Мир, 1987. Т. 1. 476 с.
Ромер А. С. и Парсонс Т. С. Анатомия позвоночных. М.: Мир, 1992. 358
с.
Фримель Г. (ред.) Иммунологические методы. М.: Медицина, 1987. 472 с.
Юдкин И. И. Ихтиология. Москва-Ленинград: Пищепромиздат, 1941.
Aguilera R. J., Akira S., Okazaki K.,Sakano H. A pre-B cell nuclear
protein wich specifically interacts with the immunoglobulin V-J
recombination sequeces // Cell. 1987. V. 51. P. 909-917.
Anderson M. K., Shamblott M. J., Litman R. T., Litman G. W.
Generation of immunoglobulin light chain gene diversity in Raja erinacea is
not associated with somatic rearrangement, an exception to a central
paradigm of B cell immunity // Journal of Experimental Medecine. 1995. V.
182. P. 109-119.
Bengten E. The immunoglobulin genes in Atlantic cod (Gadus morhuna)
and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) // Dissertations from the Faculty
of Science and Technology. 1994. V. 19.
Bengten E., Leanderson T., Pilstrom L. Immunoglobulin heavy chain
cDNA from Atlantic cod (Gadus morhuna L.): nucleotide sequences of
secretory and membrane form show an unusual splicing pattern // European
Journal of Immunology. 1991. V. 21. P. 3027-3033.
Blomberg B., Tonegawa S. DNA sequences of the joining regions of
mouse ( light chain immunoglobulin genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
1982. V. 79. P. 530.
Boyle J. S., Lew A. M. An inexpensive alternative to glassmilk for
DNA purification // Trends in Genetics. 1995. V. 11. No. 1. p. 8.
Chomczynski P. and Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by
acid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Analytical
biochemistry. 1987. V. 162. P. 156-159.
Daggfeldt A., Bengten E., Pilstrom L. A claster type organization of
the loci of the immunoglobulin light chain in Atlantic cod (Gadus morhuna
L.) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum) indicated by nucleotide
sequences of cDNAs and hybridization analysis // Immunogenetics. 1993.
V.38. P. 199-209.
Dieffenbach C. W. and Dveksler G. S. (edit). PCR primer. A laboratory
manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. 714 p.
Durdik J., Moore M. W., Selsing E. Novel ( light-chain gene
rearrangements in mouse ( light-chain-producing B limphocytes // Nature.
1984. V. 307. P. 749-752.
Flajnik M. F. The immune system of ectothermic vertebrates //
Veterinary Immunology and immunopathology. 1996. V. 54. P. 145-150.
Ghaffari S. H. and Lobb C. J. Structure and genomic organization of
immunoglobulin light chain in the channel catfish // The Journal of
Immunology. 1993. V. 151. P. 6900-6912.
Gilbert W. Evolution of antibodies: the road not taken // Nature.
1990. V. 320. P. 485.
Greenberg A. S., Steiner L.,Kasahara M., Flajnik M. F. Isolation of a
immunoglobulin light chain cDNA clone encoding a protein resembling
mammalian ( light chains: Implications for the evolution of light chains //
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 10603-10607.
Haire R. N., Ota T., Rast J. P., Litman R. T., Chan F. Y., Zon L. I.,
Litman G. W. A third Ig light chain gene isotype in Xenopus laevis consists
of six distinct VL families and is related to mammalian ( genes // The
Journal of Immunology. 1996. V. 157. P. 1544-1550.
Hesse J. E., Lieber M. R., Mizuuchi K., Gellert M. V(D)J
recombination: the functional difinition of the joining signals // Genes
Dev. 1989. V. 3. P. 1053-1061.
Hieter P. A., Hollis G. F., Korsmeyer S. J., Waldmann T. A., Leder P.
Clastered arrangement of immunoglobulin ( constant region genes in man //
Nature. 1981. V. 294. P. 536.
Hieter P. A., Maizel J. V., Leder J., Leder P. Evolution of human
immunoglobulin ( J region genes // J. Biol. Chem. 1982. V. 257. P. 1516.
Hohman V. S., Schluter S.F., Marchalonis J. J. Complete sequence of a
cDNA clone specifying sandbar shark immunoglobulin light chain: Gene
organization and implications for the evolution of light chains // Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 276-280.
Hohman V. S., Schuchman D. B., Schluter S.F., Marchalonis J. J.
Genomic clone for sandbar shark ( light chain: Generation diversity in the
absence of rearrangement // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P.
9882-9886.
Hsu E., Lefkovits I., Flajnik M., Pasquier L. D. Light chain
heterogeneity in the amphibian Xenopus // Molecular Immunology. 1991. V.
28. P. 985-994.
immunoglobulin genes and the antibody repertoire // Molecular Biology
Evolution. 1993. V. 10(1). P. 60-72.
Litman G. W., Rast J. p., Shamblott M. J., Haire R. N., Michele H.,
Roess W., Litman R. T, Hinds-Frey K. R., Zilch A., Amemiya C. T.
Phylogenetic diversification of Lobb C. J., Olson M. O. J., Clem W. L.
Immunoglobulin light chain classes in a teleost fish // The Journal of
Immunology. 1984. V. 132. P. 1917-1923.
Lundqvist M., Bengten E., Stromberg S., Pilstrom L. Ig light chain
gene in the siberiah sturgeon (Acipenser baeri) // The Journal of
Immunology. 1996. V. 157. P. 2031-2038.
Maisey J. G. Chondrichthyan phylogeny: a look at the evidence // J.
Ven. Paleont. 1984. V. 4. P. 359-371.
Rast J. P., Anderson M. k., Ota T. Litman R. T., Margittai M.,
Shamblott M. J., Litman G. W. Immunoglobulin light chain class multiplisity
and alternative organizational form in early vertebrate philogeny //
Immunogenetics. 1994. V. 40. P. 83-89.
Reynaund C. A., Anquenz V., Grimal H., Weill J. C. A hyperconversion
mechanism generates the chicken light chain preimmune repertoire // Cell.
1987. V. 48. P. 379-388.
Roitt I., Brodstoff J., Male D. Immunology. London: Mosby-Year Book
Europe, 1993.
Romer A. S. Vertebrate Paleontology. Chicago: University Chicago
Press, 1966.
Sakano H., Huppi K., Heinrich G., Tonegawa S. Sequences at the
somatic recombination sites of immunoglobulin light-chain genes // Nature.
1979. V. 280. P. 288.
Sakano H., Maki R., Kurosawa Y., Roeder W., Tonegawa S. Two types of
somatic recombination are necessary for the generation of complete
immunoglobulin heavy-chain genes // Nature. 1980. V. 286. P. 676.
Sanger F., Niklen, S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-
terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1977. V. 74. P.
5463-5467
Schatz G. D., Oettinger A. M., Schlissel M. S. V(D)J recombination:
molecular biology and regulation // Annual Review of Immunology. 1992. V.
10. P. 359-383.
Schwager J., Burckert N., Schwager M., Wilson M. Evolution of
immunoglobulin light chain genes: analysis of Xenopus IgL isotypes and
their contribution to antibody diversity // The EMBO Journal. 1991. V. 10.
P. 505-511.
Seidman J. G., Max E. E., Leder P. A. A ( immunoglobulin gene is
formed by site - specific recombination without further somatic mutation //
Nature. 1979. V. 280. P. 370.
Shamblott M. J. and Litman G. W. Genomic organization and sequences
of immunoglobulin light chain genes in a primitive vertebrate suggest
coevolution of immunoglobulin gene organization // The EMBO Journal. 1989.
V. 8. P. 3733-3739.
Shankey T.V. and Clem L.W. Phylogeny of immunoglobulin structure and
function. IX. Intramolecular heterogeneity
of shark 19S IgM antibodies to the dinitrophenyl hapten //
J. Immunol. 1980. V. 125. P. 2690-2698.
Stavnezer J., Kekish O., Batter D., Grenier J., Balazs I., Henderson
E., Zegers B. J. Aberrant recombination events in B cell lines derived from
(-deficient human // Nucl. Acids Res. 1985. V. 13. P. 3495-3514.
Stewart S. E., Pasquier L. D., Steiner L. A. Diversity of expressed V
and J regions of immunoglobulin light chains in Xenopus laevis // European
Journal of Immunology. 1993. V. 23. P. 1980-1986.
Strob U. Transgenic mise with immunoglobulin genes // Annual Review
of Immunology. 1987. V. 5. P. 151-174.
Thompson G. B. and Neiman P. E. Somatic diversification of the
chicken immunoglobulin light chain gene is limited to the rearranged
variable gene segment //Cell. 1987. V. 48. P. 369-378.
Tonegawa S. Somatic generation of antibody diversity // Nature. 1983.
V. 302. P. 575-581.
Udey J. A., Blomberg B. Human ( light chain locus: organization and
DNA sequences of three genomic J regions // Immunogenetics. 1987. V. 25. P.
63.
Wai Lin Tung, King-C. Chow. A modified medium for efficient
electrotransformation of E.coli // Trends in Genetics. 1995. V. 11. No. 4.
Р. 128-129.
Wilson M., Hsu E., Marcuz A., Courent M., Pasquier L. D., Steinberg
C. What limits affinity maturation of antibodies in Xenopus: the rate of
somatic mutation or the abilityto select mutants? // The EMBO Journal.
1992. V. 11. P. 4337.
Zezza D. J., Mikoryak C. A., Schwager J., Steiner L. A. Sequence of C
region of L chains from Xenopus laevis Ig // The Journal of Immunology.
1991. V. 146. P. 4041-4047.
Zezza D. J., Stewart S. E., Steiner L. A. Genes encoding Xenopus
laevis Ig L chains. Implications for the evolution of ( and ( chains // The
Journal of Immunology. 1992. V. 149. P. 3968-3977.
-----------------------
L-цепь
VL
H-цепь
СL
VH
СH1
СH2
СH3
( тип
JC(1 JC(2 JC(3 JC(4 JC(5 JC(6 JC(7
V(1 V(2 V(n
3’
5’
( гены
V(1 V(2 V(n J(1 - J(5 C(
VL...VLm гептамер нонамер ... VLn JL1 нонамер гептамерJL2
... JL5
ACAAAAACC
11 пн
22 пн
CACTGTG
GGTTTTTGT
CACAGTG
A
(VL JL CL)1 (VL JL CL)2 (VL JL CL)n
3 - 6 тпн
Б
(VJL CL)1 (VJL CL)2 (VJL CL)n
(VL1 VL2 JL CL)1 (VL1 VL2 JL CL)2 (VL1 VL2 JL CL)n
5 тпн
L1 локус
VL11 VL12 VL1n JL11 - JL15 CL1
L3 локус
(VL31 VL3n)1 (VL31 VL3n)6 JCL31 JCL32
V JC
( )n
V J C
Переход от
кластерной к
сегментарной
форме организации
дупликации
V C
внедрение
транспозона в V-ген
дупликация и дивергенция
Предковый
Ig-подобный ген
кисте-перые
ильные рыбы
наземные позвоночные
костистые рыбы
панцирные щуки
двояко-дышащие
костные лучеперые
костные кистеперые
костно-
хрящевые
первичнокостные
примитивные
первично-костные
рыбы
акулообразные
хрящевые рыбы
миксины
миноги
первично-челюстные
щитковые
первично-круглоротые
наружно-жаберные
внутренне-жаберные
первично-черепные
бесчерепные
первично-бесчерепные
синтез кДНК,
сшивка с EcoR I адапторами, обработка рестриктазой Xho I,
фосфорилирование концевых нуклеотидов
сшивка с вектором, расщепленным по сайтам рестрикции Xho I и EcoR I
фрагмент кДНК
кДНК
T3
C1
J
V
векторвектор
J-некод
400
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8
