и инкубировали 1 час при 55оС. После этого добавляли меченую 32P-дATФ ДНК
зонда и инкубировали 12-18 часов при 55оС при постоянном покачивании.
После гибридизации проводили промывание мембраны два раза по 10 мин в
200 мл 2-кратного SSC + 0,1% SDS при комнатной температуре, 15 мин в 1-
кратном SSC + 0,1% SDS% при 55оС и два раза по 10 мин в 0,1-кратном SSC +
0,1% SDS при 55оС. Экспонирование проводилось в течение 12 часов при -70оС
с рентгеновской пленкой (Маниатис и др., 1984).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК
Нуклеотидную последовательность ДНК определяли по методу Сэнгера
(Sanger et al., 1977). 5 мкг плазмидной ДНК, очищеной гель-фильтрацией на
колонке с биогелем П-10, денатурировали в 50 мкл 0.2 М NaOH при 37оС в
течение 30 мин, затем добавляли 5 мкл 3 М NaAc, рН 5,1, двойной объем
этанола и инкубировали 30 мин при температуре -70оС. После этого осаждали
ДНК центрифугированием при 12000 g в течение 12 мин и промывали осадок 100
мкл 80% этанола. Осадок ДНК высушивали при комнатной температуре и
растворяли в 7,5 мкл воды, добавляли 2 мкл 5-кратного буфера (200 мМ трис-
HCl, рН 7,5, 100 мМ MgCl2, 250 мМ NaCl), 0,5 мкл праймера (50 нг) и
инкубировали 30 мин при 37оС. После этого пробирку помещали в лед и
добавляли 1 мкл 0,1 М ДТТ, 2 мкл 1,5 мкМ дНTФ без дATФ, 0,5 мкл раствора
35S-дATФ и 2 мкл ДНК полимеразы фага Т7 (2,5 е.а./мкл). Затем инкубировали
3 мин при 20оС и сразу отбирали по 3,5 мкл в четыре пробирки, каждая из
которых содержала по 2,5 мкл 80 мкМ смеси четырех дНTФ, 50 мМ NaCl и 8 мкМ
одного из ддНTФ. Инкубировали 5 мин при 37оС и добавляли по 4 мкл стоп-
раствора (95% формамид, 20 мМ Na2ЭДТА, 0,05% бромфеноловый синий, 0,05%
ксилен цианол). Полученные образцы инкубировали 3 мин при 100оС, быстро
охлаждали до 0оС и отбирали по 2 мкл для электрофореза в денатурирующем
полиакриламидном геле, имеющем состав:
6% акриламид,
8 М мочевина,
1-кратный глицерин-толерантный буфер (1,1% трис, 0,36% таурин, 0,02%
Na2ЭДТА).
Электрофорез проводили при напряжении 40 В/см. Затем гель выдерживали
30 мин в 10% уксксной кислоте, высушивали и экспонировали 12 часов при
комнатной температуре с рентгеновской пленкой (Маниатис и др., 1984).
САУЗЕРН БЛОТ ГИБРИДИЗАЦИЯ
10 мкг геномной ДНК, выделенной из печени стерляди, инкубировали в
течение 2 часов с эндонуклеазами рестрикции Pst I и Pvu II (по 50 е.а.) при
37оС в буфере, содержащем 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgCl2,
100 мкг/мл бычий сывороточный альбумин, 6 мМ 2-меркаптоэтанол. Затем
экстрагировали ДНК последовательно равными объемами фенол-хлороформа (1:1)
и хлороформа, осаждали ДНК двумя объемами этанола, растворяли в воде и
наносили на 1% агарозный гель. Электрофорез проводили при напряжении 1 В/см
и температуре 12оС в течение 12 часов. Затем гель инкубировали при
комнатной температуре 30 мин в 0,25 М HCl, 30 мин в денатурирующем растворе
(0,5 М NaOH, 1,5 M NaCl) и 10-15 мин в растворе 1 (0,25 М NaOH, 1,5 M
NaCl). После этого ДНК переносили на нейлоновую мембрану методом вакуумного
переноса в растворе 1. Мембрану споласкивали в 2-кратном SSC, высушивали и
фиксировали ДНК в течение 10 мин ультрафиолетовым излучением с длиной волны
310 нм.
Предгибридизацию проводили при 55оС в течение 1 часа в растворе 1
(см. Скрининг библиотеки кДНК). Гибридизация длилась 12-16 часов при 55оС с
концентрацией зонда не более 10 нг/мл.
Отмывку проводили два раза по 10 мин в 2-кратном SSC + 0,1% SDS при
комнатной температуре и один раз 15 мин в 1-кратном SSC + 0,1% SDS при
55оС. Экспонирование длилось 12 часов при -70оС (Маниатис и др., 1984).
РЕЗУЛЬТАТЫ
КОНСТРУИРОВАНИЕ БИБЛИОТЕКИ кДНК И ЕЕ СКРИНИНГ
В качестве источника мРНК брали лейкоциты периферической крови
стерляди. На основе этой мРНК синезировали кДНК. Полученные молекулы кДНК
клонировали в плазмидном векторе pBluescript KS(+), после чего
трансформировали этим вектором клетки E.coli штамма XL-1 Blue MRF’. В
результате этого была получена библиотека кДНК представительностью 6
миллионов клонов. Библиотеку амплифицировали до объема 5 х 1011 клеток.
Cуммарную плазмидную ДНК библиотеки выделяли и использовали в ПЦР с
парой праймеров, один из которых гомологичнен участку вектора вблизи
сайта клонирования молекулы кДНК и располагается в кодирующей ориентации.
Второй праймер вырожденный, соответствующий наиболее консервативному
участку последовательности J-сегментов L-цепей ИГ позвоночных в
некодирующей ориентации (рис. 10).
Один из фрагментов ДНК, полученных в результате ПЦР, соответствовал
ожидаемому размеру (370 пн). Этот фрагмент выделяли и субклонировали в
векторе pBluescript KS(+). Определение нуклеотидной последовательности
этого фрагмента показало, что он гомологичен генам V области L-цепей ИГ
(Рис. 11).
Этот фрагмент был использован в качестве зонда для скрининга
библиотеки кДНК лейкоцитов стерляди. Скрининг 4000 колоний библиотеки кДНК
в мягких условиях гибридизации позволил выявить пять клонов с размером
вставки кДНК от 800 до 1050 пн. Для четкого разделения клонов проводили
вторичный скрининг библиотеки кДНК, после чего выделенные клоны
амплифицировали.
прамер Т3
5'-GCAATTAACCCTCACTAAAGG-3';
J-праймер
5'-A(G/C)(T/C)(T/C)TGGT(T/G/C)CCTTTTCC(A/G)AA-3’
Рис. 10. Схема ПЦР. Т3 праймер располагается вблизи сайта
клонирования молекулы кДНК и комплиментарен некодирующей цепи, J-праймер
гомологичен участку кодирующей цепи J-сегмента генов L-цепей ИГ
позвоночных. Ожидаемая длина продуктов около 400 пн.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ
Определена нуклеотидная последовательность вставки кДНК клона В1.
кДНК клона В1 размером 1050 пн представляла собой полноразмерную копию
зрелого гена L-цепи ИГ и содержала 5’-нетранслируемую область,
последовательность кодирующую лидерный пептид, V область, С область, а
также 3’-нетранслируемую область (Рис. 11). На основе первичной структуры
клона В1 сконструировали и синтезировали три праймера, соответствующих
консервативным районам V и C области и использовали их для определения
нуклеотидной последовательности клонов Е4 и С2. Последовательность клона Е4
была определена только в области, примыкающей к Т3 промотору вектора. За
исключением 2 нуклеотидов она полностью идентична последовательности В1.
Последовательность клона С2 имела химерный характер. В области Т3 промотора
она содержала фрагмент соответствующий 3’ части С сегмента клона B1 с
заменами нескольких нуклеотидов. В то же время использование для
определения последовательности праймеров V и C области показало, что эта
вставка содержит дополнительно перестроенный ген легкой цепи, содержащий
большую часть V сегмента и второй С сегмент, отличающийся от первого в
одной позиции. Поскольку пока не удалось определить последовательность в
области стыка этих двух фрагментов вставки, нельзя сказать, находятся ли
они в одной или разных ориентациях. По-видимому, сходный химерный характер
имеет последовательность клона D2 (данные не показаны).
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ
Нуклеотидную и предсказанные аминокислотные последовательности клона
В1 сравнивали с последовательностями V и C генов L-цепей ИГ других видов
позвоночных (Рис 12). На аминокислотном уровне V область имеет наибольшее
сходство с V-областями L-цепей класса F и G пещерного сомика и с V-областью
L1 класса ИГ форели (63-71%). И те и другие относятся к каппа-типу L-
цепей. При поиске гомологов в полном банке последовательностей ИГ
млекопитающих первые 100 позиций с наибольшим сходством представляли собой
также V каппа области.
С-область клона В1 имеет на аминокислотном уровне приблизительно
одинаковое и не очень значительное сходство с широким спектром С-областей L-
цепей ИГ хрящевых и костистых рыб (41-44%). На нуклеотидном уровне наиболее
близкими гомологами В1С гена являются гены III класса хрящевых рыб (65%).
АНАЛИЗ ГЕНОМНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ
Геномную организацию локуса генов L-цепей ИГ стерляди оценивали
методом Саузерн блот гибридизации. Геномную ДНК выделяли из печени
стерляди. ДНК расщепляли эндонуклеазами рестрикции Pst I и Pvu II. После
электрофоретического разделения и переноса фрагментов ДНК на
нитроцеллюлозную мембрану проводили гибридизацию в мягких условиях. В
качестве зонда на V-гены использовали фрагмент, полученный в результате ПЦР
(см. Конструирование библиотеки кДНК и ее скрининг). В качестве С-зонда
использовали участок кДНК клона В1, кодирующий CL сегмент, который вырезали
по сайтам рестрикции эндонуклеазами EcoR V-Xho I.
V-зонд выявлял более 20 гибридизующихся фрагментов ДНК, в то время
как С-зонд гибридизовался только с 3-4 фрагментами (рис. 13).
5' нетранслируемая область |> лидерный пептид
1 15 30 45 60
75 90
B1 . .TTCATGGCAACA GAATCCACAACAACA ATGACTTTTATCAGC ATCTTCATCTGGGCA
CTTGTCATCTGCACT CAGGAATCCAGTGGA
E4 CCC----A------- --------------- --------------- ---------------
--------------- ---------------
C2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . .
C2(T3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
|> V сегмент FR 1
|> CDR 1
105 120 135 150
165 180
B1 CAGTATACTGTGACT CAGACTCCAGCAGAG AAATCTGTTCTCCCA GGAGACACAGTCGCT
CTCAACTGTAAAGTC AACAGCGCAGTCCTT
E4 --------------- --------G----T- --------------- ----------. . .
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8
