Патогенетические механизмы болезней иммунных
комплексов (Сура В.В., 1987)
Рис. 1.3.2.
В результате развития эндотоксемии при сальмонеллезе организм
длительное время контактирует с избытком АГ как экзогенного (компоненты
микробных клеток), так и эндогенного (компоненты разрушенных клеток самого
организма) происхождения. Вместе с тем наблюдается угнетение системы
комплемента, ответственного за лизис микробных клеток. В этих условиях
значительного избытка АГ и недостаточности выработки АТ может привести к
образованию ИК, которые способны откладываться в определенных тканях и
вызывать острые воспалительные реакции. При значительных отложениях
наблюдаются функциональные и морфологические повреждения органов и тканей
[35].
Связываясь с клеточной мембраной ЦИК вызывают выделение в окружающую
среду протеолитических ферментов и основных пептидов. Эти вещества
повреждают протеогликановые компоненты тканей, действуют на базальную
мембрану и вызывают некроз эндотелиальных клеток [36].
ЦИК наряду с продуктами ПОЛ вызывают нарушение проницаемости мембран,
вплоть до их разрыва, что в конечном итоге может привести к гибели клетки.
В результате появляются различные вещества пентидной природы. Из них
наибольший интерес представляют молекулы средней массы.
Являясь олигопептидами с молекулярной массой 300-5000 Дальтон, они
расцениваются как универсальный критерий эндогенной интоксикации и влияют
на ее уровень и прогноз [37, 38].
МСМ образуются в организме под воздействием повреждающих эндогенных
или экзогенных факторов различного генеза, являются промежуточными
продуктами протеолиза. [39, 57].
Пристальное внимание исследователей к МСМ объясняется высокой
биологической активностью их отдельных фракций, которые ингибируют
гликолиз, глюконеогенез, пентозный цикл, синтез гемоглабина, нуклеиновых
кислот, мембранный транспорт, дагоцитов, эритропоэз, микроциркуляцию,
обладают иммунодепрессивным, цитотоксическим, нейро- и психотропным
свойствами. Сейчас, квалификационная оценка степени тяжести состояния
больных при сальмонеллезе немыслима без определения МСМ [40].
Установлено, что значительная часть циркулирующих в крови СМ не
только растворена в плазме крови, но и связана с альбумином.
Человеческий сывороточный альбулин (ЧСА) – важнейший транспортный
белок, осуществляющий перенос эндогенных метаболитов и ксенобиотиков в
плазме крови, межклеточной жидкости, в лимфе.
Универсальность транспортной функции ЧСА обеспечивается его
уникальной способностью связывать лиганды различной химической природы.
Интенсивная лигандная нагрузка молекул альбулина приводит к изменению их
структуры и связывающей способности. Такие модификационные формы ЧСА
обнаруживаются при патологии [41].
О величине токсического действия вредных веществ можно судить по ЭКА,
которая снижается после того, как токсические вещества займут центры
связывания в молекуле альбулина, что приводит к снижению детоксикационных
свойств организма. Изучение свойств альбулина является важным с точки
зрения как диагностики, так и лечения [42].
2. Материалы и методы исследований
1. Материал исследований
Уровень интоксикации оценивался по изменениям в крови больных
эффективной и общей концентраций сывороточного альбулина, малонового
диальдегида, как одного из продуктов ПОЛ, уровня холестерина, ЦИК, МСМ и
активности каталазы.
Для всех исследований бралась сыворотка крови. Исследовано 30 больных
сальмонеллезом в возрасте от 17 до 46 лет. Для контроля набиралась группа
51 человека разного пола в возрасте от 20 до 46 лет.
Кровь бралась из локтевой вены, преимущественно натощак в количестве
не менее 5 мл. Центрифугируем 1500 об/мин 10 минут. Для выполнения анализов
сыворотки необходимо использовать сразу или заморозить и хранить при t=-
20[pic]С.
2. Методы исследований
2.2.1. Определение МДА с тиобарбитуровой кислотой
(Конюхова В.С., 1989)
Об изменении интенсивности ПОЛ судим по изменению уровня вторичного
продукта ПОЛ – малонового диальдегида.
Метод основан на том, что при высокой температуре в кислой среде МДА
реагирует с 2-ТБК, образуя окрашенный розовый триметиновый комплекс с
максимумом поглощения при 535 им.
Ход работы: К 0,2 мл сыворотки крови добавить 0,2 мл дистиллированной
воды, 1 мл 0,6 % ТБК в ледяной уксусной кислоте. Кипятить 30 минут,
охладить и добавить 1 мл 5№ КОН и 2 мл изопропанола. Центрифугируют при
6000 об/мин 20 минут. Колориметрируют при 535 нм и 580 нм против контроля,
содержащего вместо плазмы воду.
Расчет: [pic] (мкМоль/л), где Е – оптическое поглащение
изопропилового экстракта; 106 – коэффициент пересчета оптической плотности.
Пример расчета: больной Максимов С., 19 лет
[pic]
концентрация МДА = [pic] (мкМоль/л).
2.2.2. Определение активности каталазы
(Королюк М.А., 1988)
Метод основан на способности перекиси водорода образовывать с солями
молибдена стойкий окрашенный комплекс.
Ход определения: Реакция запускается добавлением 0,1 мл сыворотки
крови к 2 мл 0,03 % раствора перекиси водорода. В холостую пробу вместо
сыворотки вносят 0,1 мл дистиллированной воды. Реакцию останавливают через
10 минут добавлением 1 мл 4% молибдата аммония. Интенсивность окраски
измеряют на спектрофотометре при длине волны 410 нм против контрольной
пробы, в которой вместо перекиси водорода вносят 2 мл воды.
Расчет: [pic] (мкат/л), где
Е – активность каталазы в мкат/л;
А – оптическая плотность холостой и опытной проб;
V – объем вносимой пробы, 0,1 мл;
t – время инкубации, 600 сек;
К – коэффициент миллимолярной экстинкции перекиси водорода, равный [pic].
За единицу активности каталазы принимают то количество фермента,
которое участвует в превращении 1 мкат перекиси водорода за 1 секунду при
заданных условиях. Расчет активности каталазы ведут на 1 л сыворотки крови.
Пример расчета: больной Крайнов Т.В., 31 год.
[pic] (мкат/л)
2.2.3. Определение общего холестерина в сыворотке крови ферментативным
методом «Фотокол»
(Творогова М.Г., 1995)
Определение основано на сопряженных реакциях, которые катализирует
холестеринэстераза, холесериноксидаза и пероксидаза:
Эфиры холестерина [pic] холестерин + Ж.К.;
Холестерин + О2 [pic] холестинон + Н2О2;
Н2О2 + хромогены [pic] Н2О + окрашенный продукт.
Концентрация образующегося в ходе реакции окрашенного продукта
пропорциональна концентрации холестерина в пробе.
Ход определения: Рабочий реагент обязательно вносить в пробирки после
проб, содержащих холестерин. Пробирки встряхнуть и инкубировать при t =
37oС. Через 10 минут после начала инкубации пробирки повторно встряхнуть и
инкубировать 20 минут при t = 37oС. Окрашенные пробы фотометрировать при
500 нм в кювете с длиной оптического пути 5 мм или 10 мм относительно
холостой пробы. Окраска стабильна в течении двух часов при комнатной
температуре.
Концентрацию холестерина в исследуемых пробах рассчитать по формуле:
[pic] ммоль/л, где
ЕОП и ЕК – оптические плотности исследуемой пробы и пробы с калибратором.
Норма: 3,62 – 5,2 ммоль/л.
2.2.4. Определение циркулирующих иммунных комплексов
в крови методом ПЭГ-теста (Гриневич Ю.А., 1988)
Метод основан на селективной преципитации комплексов АТ-АГ в 3,75 %
ПЭГ (полиэтиленгликоля) с последующим определением плотности преципитата.
Реактивы:
1) 0,1 м боратный буфер (3,410 г борной кислоты, 4,275 г буры
растворить в 1 л дистиллированной воды)
2) 10 г полиэтиленгликоль – 6000 ед. растворить в 240 мл буфера.
Ход определения: К 0,3 мл сыворотки крови добавить 0,6 мл реактива
№1, перемешать и перенести по 0,3 мл в 2 пробирки. В I добавить 2,7 мл
раствора №1 (контроль). Во II добавить 2,7 мл раствора №2 (опыт).
Перемешать, инкубировать в течение 60 минут при комнатной температуре. На
спектрофотометре (КФК-3) определяют оптическую плотность в кюветах [pic]
при 450 нм.
Расчет: Высчитывают разность показателей оптической плотности,
результат умножают на 1000 и получают количество ИК в 100 мл сыворотки.
Ответ выражают в единицах оптической плотности. [pic] - количество ЦИК в
100 мл сыворотки.
Норма: 54,24 + 2,03 усл. ед.
Пример расчета: больной Максимов С.И., 19 лет.
Количество ЦИК в 100 мл сыворотки:
[pic] усл. ед.
2.2.5. Определение уровня МСМ в крови (Габриэлен Н.И., 1984)
Метод основан на осаждении белков из исследуемой жидкости 10 %
раствором ТХУ с последующем центрифугированием и определением абсорбции
света супернатантом в 10 раз разведенным дистиллированной водой.
Ход работы: Сыворотку крови обрабатывают 10 % раствором ТХУ. В
качестве контроля лучше использовать сам раствор ТХУ в 30 раз разведенный
дистиллированной водой. Оптическая плотность его против воды составляет
0,123(0,012 усл. ед. на волне 254 нм при 23-25[pic]С. Центрифигируем 3000
об/мин в течение 30 минут. К 0,5 мл надосадочной жидкости +4,5 мл
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8
