воздействии диэтилпирокарбонатом, додецилсульфатом натрия,

гуанидинтиоцианатом, фенолом и мочевиной. Агент оставался устойчивым к

обработке рядом реагентов, инактивирующих нуклеиновые кислоты, что

указывало на их отсутствие в его составе. Изучение очищенного препарата

возбудителя скрепи показало, что он обладает молекулярной массой около или

меньше 50 000 Да.

Следует отметить, что представление о прионной природе возбудителя

скрепи, выдвинутое С.Прузинером, оказалось очень плодотворным и послужило

основанием для более детального распознавания природы возбудителей ТГЭ. В

результате дальнейшей очистки приона было показано, что его основным

компонентом является мажорный белок с молекулярной массой 27000 – 30000

Да, обозначаемый как РrР 27–30. Этот белок является составной частью скрепи-

ассоциированных фибрилл, причем получены структурные и биохимические

свидетельства того, что сборка этих фибрилл происходит in vivo, и изучены

некоторые молекулярные механизмы их образования. По своей физико-химической

характеристике РrР представляет собой сиалогликопротеин и является первым

идентифицированным структурным компонентом приона скрепи. Появление РrР

27–30 на этапе развития инфекции до развития гистопатологических изменений

указывало на то, что этот белок не является вторичным продуктом

патологической реакции. Был сделан вывод о том, что РrР 27–30 играет

центральную роль в патогенезе скрепи.

При дальнейшем изучении прионов, выделенных из головного мозга

зараженных скрепи животных, было выявлено наличие в ЦНС частиц в виде

стержней диаметром 10 – 20 нм и длиной 100 – 200 нм. Ультраструктурно они

напоминали амилоид и, по-видимому, представляли собой полимерную форму

приона скрепи; каждый стержень содержал около 1000 молекул приона. Был

проанализирован аминокислотный состав PrP 27–30 и определена

последовательность 15 аминокислотных остатков в его полипептидной цепи. В

последующем из головного мозга зараженных скрепи хомяков был выделен

мажорный белок с молекулярной массой 33–37 кДа, обозначенный как HaSp

33–37; его выделение проводилось без этапа обработки протеазами. Обработка

HaSp 33–37 протеазой К приводила к получению продукта, электрофоретически

неотличимого от РrР 27–30. Была определена последовательность 22

аминокислотных остатков HaSp 33–37. Авторы полагали, что HaSp 33–37

представляет собой интактную форму белка возбудителя скрепи. Были изучены

также некоторые другие характеристики прионов скрепи и болезни

Крейтцфельдта–Якоба. В частности, при изучении липосом было подтверждено

предположение о том, что инфекционная частица скрепи содержит 2 молекулы

PrPSc и показано наличие вставок в ген приона при семейных случаях болезни

Крейтцфельдта–Якоба и синдрома Герстманна–Штреусслера–Шейнкера.

Важным шагом, имеющим как теоретическое, так и методическое значение,

было получение антител при использовании в качестве антигенов

высокоочищенных прионов скрепи. В сыворотках кроликов, иммунизированных РrР

27–30, определяли антитела, специфически реагирующие с РrР 27–30 и с

несколькими белками с более низкой молекулярной массой, очевидно, имеющими

общую антигенную детерминанту с РrР 27–30 или являющимися продуктами его

расщепления. Полученные антисыворотки не взаимодействовали с

соответствующими белками, выделенными из головного мозга нормальных

незараженных животных. Используя полученную антисыворотку с пероксидазной

меткой, удалось показать локализацию прионов в определенных отделах

головного мозга зараженных животных. В соответствии с ранее полученными

данными структуры, связанные с меченой антисывороткой, обладали

характеристикой амилоидных бляшек. Получение и использование антисыворотки

к синтетическому пептиду, соответствующему N-концевой части приона скрепи,

позволили провести индикацию белка скрепи-ассоциированных фибрилл в

головном мозге, селезенке и лимфатических узлах зараженных животных. При

этом положительные результаты были получены на ранних этапах инкубационного

периода скрепи.

Развитие представлений о прионной природе возбудителя скрепи позволило

сделать еще один решающий шаг в познании природы этих необычных агентов. В

1985 г. группе исследователей удалось выделить и охарактеризовать ген,

кодирующий PrP 27–30. Оказалось, что этот ген содержится в ДНК, выделенной

из мозга как скрепи-инфицированных, так и нормальных животных;

соответственно м РНК для PrPC была обнаружена в головном мозге и в других

тканях как инфицированных скрепи, так и нормальных животных. Используя

соответствующую антисыворотку, удалось показать, что в тканях незараженных

животных содержится белок, антигенно родственный PrP 27–30, но отличающийся

от него чувствительностью к обработке протеазой К. Были получены

доказательства того, что PrPC не кодируется гипотетической нуклеиновой

кислотой агента. Эта точка зрения поддерживается в работах R.M.Ridley,

H.F.Barker (1997). На основе этих данных были изучены биогенез и

трансмембранная ориентация клеточной изоформы белка приона скрепи.

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПРИОНОВ

Физико-химические свойства прионных белков особенно интенсивно

изучались в последние годы, в результате чего были сформированы

представления и получены новые данные о первичной, вторичной и третичной

структуре PrP. Так, при анализе первичной структуры PrPC различных видов

животных было выявлено, что 80% последовательностей PrPC у разных видов

животных были идентичными. Исключение составлял куриный PrPC, где

идентичность последовательностей по отношению к другим видам составляла

всего 30%. Тем не менее 24 аминокислотные последовательности,

располагающиеся между 112-м и 135-м аминокислотными остатками, являются

высококонсервативными для всех видов млекопитающих, а также кур. В

частности, было показано, что конверсия нормального прионного белка PrPC в

его инфекционную форму (PrPSc) является посттрансляционным процессом.

Анализ вторичной структуры PrPSc выявил, что этот переход характеризуется

большими структурными изменениями самого приона. Продемонстрировано, что

PrPC содержит 42% (-спиралей и почти не содержит (-тяжей (около 3%), в то

время как в его инфекционной форме PrPSc выявляется 30% (-спиралей и 43% (-

тяжей. В экспериментальных исследованиях было подтверждено, что обработка

нормального PrPC реагентами, уменьшающими образование (-тяжей, также

приводит к уменьшению инфекционности приона; одновременно снижается и

устойчивость к действию протеазы К, чувствительность к которой является

маркером, отличающим PrPC от PrPSc.

Проведенный сравнительный анализ показал, что конформационные различия

между нормальным и инфекционным прионным белком заключаются в трехмерной

конформации. Переход нормального PrPC в его патологическую форму имеет в

своей основе перестройку укладки белка. Корреляция изменений во вторичной

структуре PrP с изменениями его инфекционности вместе с изменением

конформации PrP дает основания заключить, что конформация прионного белка

может иметь главное значение для проявления его патогенных свойств.

Были изучены некоторые закономерности перехода клеточной формы приона

PrPC в его инфекционную форму и выявлено, что эффективность этой конверсии

определяется видовой гомологией PrPC и PrPSc и, следовательно, в условиях

гетерологичности обеих форм прионного белка эффективность конверсии

снижается. Этим и объясняется механизм низкой инфекционности прионов в

гетерологичной системе (например, животные – человек). Значение этой

конверсии в развитии инфекционного процесса было подчеркнуто в

экспериментальных исследованиях, показавших, что мыши, не экспрессирующие

PrPC, устойчивы к инфекции прионами.

В исследованиях in vitro, проведенных на модели агентов ТГЭ, также

была установлена корреляция между эффективностью конверсии PrPC в PrPSc и

способностью к трансмиссии агентов скрепи, губкообразной энцефалопатии

коров и болезни Крейтцфельдта – Якоба. Было продемонстрировано, что

конверсия PrPC в PrPSc в гетерологичной системе значительно снижена по

сравнению с гомологичной системой. Авторы делают из своей сугубо

экспериментальной работы практически важный вывод о том, что способность

агентов скрепи и губкообразной энцефалопатии коров поражать людей после

соответствующей экспозиции является ограниченной и низкой.

Таким образом, в результате разносторонних исследований, особенно

интенсивно проводившихся в 90-е годы, были получены и систематизированы

имеющие принципиальное значение данные о структуре и физико-химических

свойствах прионных белков. Получение и анализ этих сведений создали

необходимые предпосылки для дальнейшего углубленного изучения биологических

особенностей прионных белков и механизма развития вызываемых ими

заболеваний людей и животных.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПРИОНОВ

В последние годы вопрос о биологическом значении PrPC был подвергнут

ревизии. На мышах, гомозиготных по потере гена PrPC, было показано, что эти

животные после рождения росли нормальными, но спустя 70 нед у них

развивались прогрессирующие симптомы атаксии, нарушалась моторная

координация и отмечалась экстенсивная потеря клеток Пуркинье. Авторы

сделали вывод о том, что PrPC играет важную роль в выживании клеток

Пуркинье. Помимо этого, указывается на роль PrPC в регуляции циркадианных

ритмов, на возможное участие PrPC в активации лимфоцитов и на его роль в

качестве трофического фактора для некоторых популяций нейронов. Сохранность

PrPC имеет значение для реализации нормальной функции синапсов. В последние

годы опубликованы данные, свидетельствующие о роли PrPC в регуляции сна и

продемонстрировано значение нарушения нормальной функции PrPC в

возникновении смертельной семейной бессонницы. В исследованиях in vitro

было также показано, что PrPC вовлекается в процессы регуляции содержания

внутриклеточного Са2+ в нейронах, Интенсивные исследования биологической

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8