- изменения разницы потенциалов, оптической плотности, силы тока и т. п.
Одним из первых применений иммуносенсоров было измерение количества антител
при сифилисе. Для этого на полупроницаемой мембране электрода связывали
антигены трепонемы и инкубировали его в растворе сыворотки крови. Изменения
разницы потенциалов наблюдали вплоть до разведения положительной
контрольной сыворотки 1:800, причем, увеличение сигнала соответствовало
повышению концентрации антител. Важно то, что после отмывания иммуносенсор
можно использовать вновь. Аналогичный подход был применен для определения
антител другой специфичности (к групповым антигенам крови) и альбумина.
Более сложное строение иммуносенсора увеличивает чувствительность анализа.
Так при использовании меченого иммуносенсора достигается чувствительность
до 0,1 нг белка/мл. Имеются данные об определении таким методом HBs-
антигена с помощью I-электрода и антител к HBs-антигену, меченых
пероксидазой [Аizawа М., 1987]. Устройство, включающее стеклянную матрицу,
активированную различными вирусными антигенами (биочип) было использовано
для серологической диагностики вирусных заболеваний [Ноrbach Е. еt аl.,
1989]. Предприняты попытки определять с помощью иммуносенсоров продукты
синтеза некоторых грибов (охратоксин А), клетки С. Albicans.
Хотя в настоящее время отсутствуют коммерческие образцы иммуносенсоров
для диагностики инфекционных заболеваний, следует обратить внимание на
основные этапы использования подобных устройств.
Опыт использования аналогичных систем для определения глюкозы в крови,
гормонов, низкомолекулярных веществ позволяет разделить процесс анализа на
три этапа:
1 - подготовка образца для анализа
Некоторые типы иммуносенсоров способны взаимодействовать
непосредственно с биологическим материалом. Однако чаще всего используется
предварительно отделенная центрифугированием плазма или сыворотка крови,
разведенная специальным раствором.
2 - проведение аналитической процедуры
Помещая каплю раствора на микроэлектрод, или опуская электрод в
исследуемый образец, создается контакт реагентов. Время достижения
равновесия от нескольких секунд (для низкомолекулярных веществ) до
нескольких минут (для высокомолекулярных агентов, антигенов, клеток).
Результат определяется по разнице в показаниях с референс-электродом или по
изменению сигнала после реакции. Результат может быть выражен в
систематических единицах (милливольт, миллиампер), либо с помощью
микропроцессора трансформирован в единицы концентрации искомого агента, в
соответствии с предварительным калиброванием.
3 - регенерация иммуносенсора
Для повторного или многократного использования иммуносенсора
необходимо освободить его рабочую поверхность от веществ, активно или
пассивно сорбированных в ходе анализа. Наиболее простой способ регенерации
состоит в интенсивном последовательном промывании иммуносенсора раствором с
кислым значением рН и буферным раствором с высокой ионной силой. Для
некоторых типов иммуносенсоров до сих пор не найдено оптимальных условий
регенерации, не снижающих их чувствительность. В этих случаях используют
сменные одноразовые мембранные элементы.
В ближайшее время будут созданы надежные портативные иммуносенсоры для
диагностики наиболее распространенных инфекционных заболеваний, как это
сделано уже для анализаторов глюкозы.
МЕТОДЫ ГЕННОГО ЗОНДИРОВАНИЯ
Интенсивное развитие молекулярной биологии и создание совершенной
методической базы генетических исследований явились основой генетической
инженерии. В области диагностики возникло и бурно развивается направление
по определению специфических нуклеотидных последовательностей ДНК и РНК,
так называемое генное зондирование. В основе подобных методик лежит
способность нуклеиновых кислот к гибридизации - образованию двухцепочных
структур за счет взаимодействия комплементарных нуклеотидов (А-Т, Г-Ц).
Для определения искомой последовательности ДНК (или РНК) специально
создается, так называемый, зонд полинуклеотид с определенной
последовательностью оснований. В его состав вводят специальную метку,
позволяющую идентифицировать образование комплекса. Схема реакции
представлена на рисунке.
[pic]
Рис. Схема реакции генного зондирования для обнаружения в образцах
ДНК или РНК микроба специфическим меченым зондом.
Хотя генное зондирование нельзя отнести к методам иммунохимического
анализа, основной его принцип (взаимодействие комплементарных структур)
методически реализуется теми же способами, что и индикаторные методы
иммунодиагностики. Кроме того, методы генного зондирования позволяют
восполнить информацию об инфекционном агенте в отсутствии его
фенотипической экспрессии (вирусы, встроенные в геном, «молчащие» гены).
Первые сообщения об использовании зондов были связаны с чисто
исследовательскими задачами молекулярной биологии - контролем наличия тех
или иных последовательностей ДНК в общем пуле клеточной ДНК. Различают
несколько разновидностей генного зондирования: гибридизация по Саузерну
(анализ ДНК), Nothern-блот (анализ РНК), точечная гибридизация,
гибридизация in situ. (на срезе, в мазке)
Для проведения анализа ДНК пробу подвергают денатурации с целью
получения одноцепочных структур, с которыми и реагируют молекулы ДНК- или
РНК-зонда. Для приготовления зондов используют либо различные участки ДНК
(или РНК), выделенные из естественного источника (например, того или иного
микроорганизма), как правило представленные в виде генетических
последовательностей в составе векторных плазмид, либо химически
синтезированные олигонуклеотиды. В некоторых случаях в качестве зонда
применяют препараты геномной ДНК, гидролизованной на фрагменты, иногда -
препараты РНК, особенно часто - рибосомальная РНК [Stull T.1988].
В качестве метки используют те же индикаторы, что и при различных
видах иммунохимического анализа: радиоактивные изотопы, флуоресцеины,
биотоп (с дальнейшим проявлением комплексом авидин-фермент) и т. п.
Порядок проведения анализа определяется свойствами имеющегося зонда. В
исследовательских лабораториях используют ДНК-зонды, приготовленные
самостоятельно и меченые, как правило, радиоактивным фосфором (32Р). В
настоящее время все чаще применяются коммерческие наборы, содержащие все
необходимые ингредиенты.
В большинстве случаев процедуру проведения анализа можно разделить на
следующие стадии: подготовка образцов (в том числе экстракция и денатурация
ДНК), фиксация пробы на носителе (чаще всего - полимерный мембранный
фильтр), предгибридизация, собственно гибридизация, отмывание
несвязавшихся продуктов, детекция. При отсутствии стандартного препарата
ДНК- или РНК-зонда предварительно проводится его получение и введение
метки.
Для подготовки пробы может быть необходимо предварительное
«подращивание» исследуемого материала для идентификации отдельных колоний
бактерий или увеличения концентрации вирусов в клеточной культуре.
Проводится и непосредственный анализ образцов сыворотки крови, мочи,
уретральных соскобов, форменных элементов крови или цельной крови на
присутствие инфекционного агента. Для освобождения нуклеиновых кислот из
состава клеточных структур проводят лизис клеток, а в некоторых случаях
очищают препарат ДНК с помощью фенола. Денатурация ДНК, т. е. переход ее в
одноцепочную форму, происходит при обработке щелочью. Затем образец
нуклеиновых кислот фиксируют на носителе - нитроцеллюлезной или нейлоновой
мембране, обычно путем инкубации от 10 мин до 4 час при 80 С0 в вакууме.
Далее, в процессе предгибридизации достигается инактивация свободных мест
связывания для уменьшения неспецифического взаимодействия зонда с
мембраной. Процесс гибридизации занимает от 2 до 20 ч, в зависимости от
концентрации ДНК в образце, концентрации используемого зонда и его размера.
После окончания гибридизации и отмывания несвязавшихся продуктов
проводится детекция образовавшегося комплекса. Если в состав зонда входит
радиоактивная метка, то для проявления реакции мембрану экспонируют с
фотопленкой (ауторадиография). Для других меток используют соответствующие
процедуры. Например, известен метод определения модифицированных участков
ДНК с помощью антител [Stollar В., Rashtchian А., 10987], введением в
состав зонда низкомолеку лярных компонентов (биотин, дигоксин и т. п.) с
последующим проявлением конъюгатом авидин-фермент, антитело - фермент [van
Brunt J., Klausner A. 1987].
Первые сообщения о коммерческих образцах наборов для генного
зондирования появились в 1986 г. - ими стали наборы для определения
М.pneumoniae, L.pneumoniae. Затем появились наборы для индентификации
других патогенов, в том числе - вируса иммунодефицита человека.
В настоящее время ведутся интенсивные разработки по упрощению процедуры
генного зондирования до одной - двух стадий процесса. Предприняты попытки
отказаться от сорбции материала на мембране [Edelstein Р., 1986].
Наиболее перспективным является получение нерадиоактивных (так называемых -
холодных) зондов. На этой же основе развивается методика гибридизации,
позволяющая устанавливать наличие патогена в препаратах срезов, пунктатов
ткани, что особенно важно при патоморфологическом анализе (гибридизация in
situ).
Существенным этапом в развитии методов генного зондирования явилось
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
