Банк Рефератов - Новые методы иммунодиагностики и критерии их оценки

Главная: Рефераты

Рефераты. Новые методы иммунодиагностики и критерии их оценки

твердофазном ИФА

| | | |наблюдения |сть |

| | | |(н/м) |нг/образец |

|фосфатаз|фат |Флуорометр|450(360) |10-4-10-2 |

|а |4-метилумбеллифер|ия |- |10-2 |

| |Н-аденозинмонофос|я | | |

| |фат | | | |

|аза |кислота | |630 |- |

| |Ортотолуидин(ОТ) |-//- |450,492 |2,5 |

| |0ртофенилендиамин|-//- |400 |20 |

| |(ОФД) |-//- |405(320) |5*105 |

| |(ОД) |ия | | |

|( |Ортонитрофенил-(-|Фотометрия|410,420 |0,01-10 |

|зидаза |4-метилумбеллифер| |450(360) |10-6—10-2 |

| | |ия |450(360) |2*10-2 |

| | |ия | | |

*Для фотометрических измерений указаны только наиболее часто используемые

длины волн наблюдения; для флюорометрических измерений - длины волн

флюоресценции и возбуждения (в скобках).

Специфичность диагностической системы не зависит от выбора фермент-

субстратной пары и определяется в основном чистотой и гомогенностью

используемых при конструировании диагностикума препаратов антигенов и

антител. Использование в ТФИФА не гетерогенных антиген-содержащих

препаратов и даже не очищенных бактерий и вирусов, а индивидуальных

бактериальных и вирусных белков - вот единственный, хотя и трудоемкий путь

повышения специфичности диагностических систем. То же можно сказать и о

препаратах, используемых в ТФИФА иммуноглобулинов, - желательно

использовать не цельные сыворотки и даже не суммарные гаммаглобулиновые

фракции этих сывороток, а аффинноочищенные или моноклональные антитела.

Особой популярностью в настоящее время у нас в стране пользуются

иммуноферментные конъюгаты на основе пероксидазы хрена. Это, вероятно,

сиязано с доступностью сырья для выделения этого фермента, относительно

легкостью очистки, достаточно высокой стабильностью , и большим числом

хромофорных и флуорохромных субстратов.. Тем не менее следует подчеркнуть,

что два других достаточно часто используемых в ТФИФА фермента - щелочная

фосфатаза и (-галактозидаза - в некоторых случаях имеют целый ряд

преимуществ перед пероксидазой. Это, во-первых, высокая стабильность,

растворимость и нетоксичность субстратов, а, во-вторых, возможность

использования относительно недорогих флуорохромных субстратов, применение

которых резко повышает чувствительность анализа.

Определенное значение для реализации максимальной чувствительности ТФИФА

имеет правильный выбор субстрата. Наряду с естественным желанием

использовать субстраты с высокой удельной хромофорной активностью (высокий

коэффициент молярной экстинкции окрашенного конечного продукта) необходимо

принимать во внимание такие важные факторы, как рвстворимость субстрата и

продуктов его ферментативной модификации в условиях проведения анализа и

стабильность этих субстратов при хранении и в процессе эксперимента.

Чувствительность диагностических систем на основе ТФИФА лишь частично

зависит от типа выбранной при конструировании диагностикума фермент-

субстратной пары. В основном эта чувствительность определяется другими

факторами, которые трудно учесть: способом синтеза конъюгата, гомогенностью

и удельной активностью используемых для такого синтеза антител и антигенов,

а также многочисленными па.раметрами проведения анализа (способом

иммобилизации выявляемого антигена или антител, степенью их солюбилизации в

биологическом или клиническом образце и т. д.). Именно в связи с этим в

литературе приводится такой широкий диапазон пределов чувствительности для

уже разработанных методик ТФИФА. На основании анализа этих данных трудно

рекомендовать при конструировании вновь создаваемых твердофазных

иммуноферментных систем наилучший фермент и наулучший субстрат. Следует

лишь отметить, что с помощью использованных ранее фермент-субстратных пар

метод ТФИФА позволяет выявить в исследуемом образце нанограммовые

количества антигена при использовании хромофорных субстратов и

пикограммовые количества антигена при применении флюорохромных субстратов.

Если при конструировании новой системы на основе ТФИФА невозможно или

нежелательно использование коммерческих универсальных конъюгатов

(антивидовых фермент-меченных антител), то встает вопрос о синтезе

конъюгата на основе выбранных фермента и антител. Как уже указывалось,

наиболее специфичные и высокоактивные конъюгаты могут быть получены на

основе только максимально очищенных белковых ингредиентов. Однако в связи с

относительной сложностью и трудоемкостью работ по тщательной очистке

бактериальных и вирусных антигенов в настоящее время при разработке

иммуноферментных систем часто используются либо цельные сыворотки, либо

суммарные фракции иммуноглобулинов, содержащие в своем составе как

специфические, так и балластные антитела. Антигены также часто не

подвергаются надлежащей очистке и используемый при конструировании

диагностикума белок составляет лишь небольшой процент от суммарного белка.

В связи с этим резко повышается вероятность неспецифических реакций,

особенно опасных при высокой чувствительности, которой обладают ИФ-

методики.

Большое значение для успешного использования ТФИФА в микробиологических и

вирусологических исследованиях имеет правильная интерпретация полученных

результатов. Это особенно важно при использовании клинического материала,

когда понятия «контроль» и «опыт» часто определяются с большой долей

субъективизма. Для тестирования положительных проб вначале ставят 6-8

тестов на образцах, взятых от заведомо здоровых людей и определяют среднюю

оптическую плотность контроля и стандартное отклонение при естественном

разбросе данных за счет различных методических погрешностей. Проба обычно

считается положительной, если отклонение ее оптической плотности от

контроля в 3 раза превышает стандартное.

Иммуносенсоры

Впервые принцип иммуносенсоров был использован М. Аizawа и соавт. (1977),

когда они сконструировали мембрану, способную на иммунологический ответ. В

настоящее время опубликовано несколько сообщений об использовании

аналогичного подхода для определения различных микробных антигенов или

антител к ним [Horbach Е. еt аl, 1989, Parry R. еt аl., 1990].

Принцип методов, основанных на иммуносенсорной технологии, заключается в

изменении физико-химических свойств мембраны или другого носителя,

связанного с антителами или антигенами. Уменьшение мембранного потенциала,

изменение оптических или химических свойств среды, прилегающей к носителю,

выявляются с помощью специального электрода или оптического устройства и

выражаются в виде электрического сигнала.

Существует два основных типа иммуносенсоров, различающихся по особенностям

определения реакции антиген - антитело. 1 тип - так называемый немеченый

иммуносенсор. Такое устройство состоит из металлического электрода для

потенциометрии, покрытого полупроницаемой полимерной мембраной с

иммобилизованными на ней молекулами антител (или антигена). В результате

реакции с искомым комплементарным веществом образуются иммунные комплексы

на поверхности мембраны. Это приводит к изменению заряда мембраны и ее

поверхностного потенциала. Изменение разности потенциалов и определяется

электродом.2 тип - меченый иммуносенсор. В этом случае на мембране также

иммобилизуются антитела или антиген, но реакция определяется по изменению

проводимости (амперметрия). Для этого используют кислородный электрод,

реагирующий на изменение концентрации О2 после реакции антител с антигеном,

меченым ферментом (например, каталазой). Конкуренция искомого антигена с

известным количеством меченого конъюгата дает изменение проводимости

раствора в области мембраны, что реализуется в виде электрического сигнала

на выходе электрода. В другой модификации результат цветной ферментативной

реакции может быть определен и с помощью оптического устройства.

Для оценки результатов реакции в двух описанных типах иммуносенсоров

значительно реже используют пьезоэлектрический эффект, измерение

температурных колебаний и некоторые другие способы, менее разработанные в

сравнении с электрохимическими и оптическими.

Особенностью иммуносенсоров, отличающей их от других систем

иммунохимической диагностики, является то, что информация о возникновении

иммунного комплекса непосредственно реализуется в виде физического сигнала

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7