|В 1991 году компания Хоффман-ла Рош ЛТД получила от |
|компании Cetus права и патенты на использование ПЦР. В этом|
|же году была создан Roche Molecular Systems, занимающийся |
|исключительно вопросами развития и совершенствования ПЦР. В|
|1992 году были внедрены первые стандартизованные |
|тест-системы для клинической ПЦР-диагностики AMPLICOR |
|Chlamydia trachomatis, а в 1993 году начато производство |
|этих тест систем. Многочисленные проведенные исследования |
|показали высокую чувствительность и специфичность данного |
|набора. Это позволило получить данной тест-системе |
|сертификат Food and Drug Administration (FDA) в 1993 году. |
|В 1995 году появился новый набор AMPLICOR Chlamydia |
|trachomatis/Neisseria gonorrhoeae для одновременной их |
|детекции в одной пробирке. В тесте использованы |
|биотинилированные праймеры (СР24/СР27) из криптической |
|плазмиды С. trachomatis. Чувствительность теста составляет |
|10 копий/мл, специфичность 99,6%. Тест-система включает: |
|набор для сбора и транспортировки образцов, набор для |
|выделения ДНК из цервикальных, уретральных образцов и мочи,|
|набор для амплификации и детекции. Все наборы |
|стандартизованы, полностью готовы к использованию, имеют |
|внутренний контроль, систему защиты от контаминации. |
|Научно-производственной фирмой "Литех" при НИИ |
|физико-химической медицины МЗ РФ выпускается набор |
|реагентов "Полимик" в виде трех отдельных наборов для |
|определения соответственно Chlamydia trachomatis, |
|Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum. Каждый набор |
|“Полимик” комплектуется отдельным набором для выделения ДНК|
|из биопроб. Инструкция по применению набора реагентов |
|рекомендована к утверждению экспертной комиссией Комитета |
|по новой медицинской технике МЗ РФ (протокол No 3 от |
|18.03.96 г.) и утверждена Министерством здравоохранения РФ |
|17.05.96 г. (ТУ 9398-405-17253567-96). |
|В состав реакционной смеси набора “Полимик” входит |
|внутренний контроль (рекомбинантная плазмида, содержащая |
|фрагмент-вставку размером 308 н.п.). Этот компонент |
|позволяет контролировать процесс прохождения реакции |
|амплификации, а также тестировать наличие в пробах веществ,|
|ингибирующих ПЦР. Полоса, соответствующая внутреннему |
|контролю, должна проявляться как в положительном и в |
|отрицательном контролях, так и во всех тестируемых пробах. |
|При выделении ДНК из биопробы (“Набор для выделения ДНК”) |
|используется метод экстракции ДНК из клеток хламидий с |
|помощью гуанидина тиоцианата и связывания высвобождающихся |
|нуклеиновых кислот с частицами крупнопористого стекла. Это |
|позволяет оптимизировать условия выделения и подготовки |
|проб для амплификации, а также уменьшить количество |
|манипуляций с образцом. При этом все манипуляции проводятся|
|в одной пробирке. Выход хромосомной ДНК составляет 70-80% |
|по результатам определения числа колониеобразующих единиц |
|клеток Acholeplasma laidlawii (штамм микоплазм, взятый в |
|качестве стандарта) как в случае чистой культуры, так и при|
|добавлении этих клеток к клиническому материалу, не |
|содержащему определяемых инфекционных агентов. |
|После завершения ПЦР продукты амплификации фракционируют |
|методом электрофореза в 1,5% агарозном геле. |
|Анализ результатов диагностики |
|1. В положительном контрольном образце для хламидий |
|выявляется полоса размером 501 н.п. |
|2. В отрицательном контрольном образце полоса, |
|соответствующая фрагментам генома хламидий, должна |
|отсутствовать. Появление полосы в отрицательном контроле |
|свидетельствует о контаминации компонентов набора. |
|3. В анализируемой пробе отсутствие полосы строго на уровне|
|соответствующего контроля свидетельствует об отсутствии |
|возбудителя в пробе, наличие полосы, соответствующей по |
|электрофоретической подвижности положительному контролю, |
|свидетельствует о наличии хламидий в клинической пробе. |
|4. Во всех образцах выявляется полоса оранжево-красного |
|цвета, соответствующая внутреннему контролю размером 308 |
|н.п. Полученные результаты можно документировать |
|фотографированием гелей с использованием оранжевого или |
|интерференционного (594 нм) светофильтра. При использовании|
|видеосистемы "Gel-doc" возможно документирование |
|результатов электрофореза в виде компьютерного файла, |
|доступного любым приложениям “Windows”. |
|Набор “Полимик” следует хранить при температуре - 18-20 ° С|
|в течение всего срока годности (6 месяцев). Допускается, |
|хранение и транспортировка набора при температуре не выше 0|
|° градусов не более одних суток. |
|По состоянию на третий квартал 1999 г. Минздравом России |
|помимо набора “Полимик” разрешены следующие диагностические|
|наборы для обнаружения хламидий трахоматис методом ПЦР в |
|качестве изделий медицинского назначения: |
|набор реагентов амплификационный для определения ДНК |
|хламидий (Хламидия-Ампли-тест) ТУ 9398-402-18137053-96 |
|производства АО “ВНЦМДЛ”, Москва; |
|набор реактивов для выявления нуклеотидных |
|последовательностей хламидия трахоматис методом ПЦР (Хлам |
|Ам) ТУ “9398-403-29032954-96 производства ЗАО “Внедрение |
|систем в медицину”. Москва, |
|набор реагентов для выявления ДНК хламидий трахоматис |
|методом ПЦР (Хлам-Ген) ТУ 9398-412-46482062-97 производства|
|НПФ “ДНК-технология”, Москва. |
| |
|Достоинства и недостатки различных методов обнаружения Chlamydia |
|trachomatis |
|(Taylor-Robinson О., Thomas B.J ,1991, с дополнениями Говорун В.М,|
|Бочкарев Е.Г., Парфенова Т.М., 1999) |
|Характеристика/ Метод |
|ПИФ |
|Культуральный посев |
|ИФА-методы |
|ПЦР |
|Исследуемый материал |
|Любой |
|Большинство |
|Ограничения из-за неспецифичности реакций |
|Значение правильно взятых проб |
|Решающее |
|Условия транспортировки проб |
|Если препарат фиксирован -условия не важны |
|Быстрая доставка или хранение при низкой температуре |
|Не имеет значения, если проба взята в буфер |
|Быстрая доставка или хранение при низкой to менее важно, чем для |
|культуры клеток |
|Условия хранения |
|На короткое время при +4°С длительно при -20 °С |
|+4°С - сутки-двое. Длит хранение в жидком азоте |
|3 -5 дней при +4°С Замораживание снижает чувствительность |
|На короткое время + 4°С, две недели - 20°С Длительное время - в |
|жидком азоте |
|Проверка адекватности взятия материала |
|Мазки оценивают во время тестирования |
|Не практикуется |
|Определяется, присутствует ли ДНК. |
|Потребность в специальном оборудовании |
|Люминесцентный микроскоп |
|Центрифуга |
|Комплект для ИФА |
|Амплификатор и оборудование для электрофореза |
|Обработка проб |
|Простая |
|Трудоемкая |
|Становится проще для новых тестов |
|Требует строгой предосторожности, чтобы не контаминировать ДНК |
|Чтение результатов |
|Субъективное и утомительное |
|Субъективное умеренно утомительное |
|Объективное, Простое |
|Объективное, простое |
|Время выполнения |
|30 минут |
|12-72 часа |
|3 часа |
|4,5-5 часов |
|Способы проверки результатов |
|Повторный просмотр |
|Повторение теста |
|Повторная проба или переваривание эндоуклеазой |
|Результат зависит от следующих причин: |
|Опыта микроскописта |
|Чувствительности клеточной культуры |
|Присущей мощности теста |
|Требует хорошего контроля и отсуствия контаминации |
|Способность к поддержанию штамма |
|Нет |
|Да |
|Использование как контроля эффективности лечения |
|Ограничено |
|Рекомендуется |
|Рекомендуется с ограничениями |
Страницы: 1, 2, 3
