|точки зрения” результаты. Это связано с тем, что невозможно|
|однозначно оценить жизнеспособность и патогенность |
|микробной клетки на основании выявления фрагмента ее |
|генома, используя только данные молекулярно-биологических |
|методов. В этом случае при исследовании клинического |
|материала с помощью культурального посева микробные клетки,|
|потерявшие эти важные с клинической точки зрения свойства, |
|не дадут роста в клеточной культуре. |
|Для транспортировки и хранения клинического материала |
|используют специальную питательную среду (транспортная |
|среда). Она разливается в пенициллиновые флаконы по 1 мл и |
|хранится при температуре + 4 ° С (в общей камере бытового |
|холодильника) в течение 2-х месяцев. Состав транспортной |
|среды: среда MEM с добавлением 10% сыворотки крупного |
|рогатого скота и антибиотика гентамицина концентрации 50 |
|мкг/мл . |
|Клинический материал после перенесения в транспортную среду|
|хранится в общей камере холодильника при температуре + 4 ° |
|С и, в течение двух суток должен быть доставлен в |
|лабораторию. |
|Процедура посева |
|1. Обработка однодневной клеточной культуры МсСоу 1% |
|раствором ДЕАЕ декстраном в течение 30 минут. |
|2. Заражение обработанных клеток материалом, полученным от |
|больных. |
|3. Центрифугирование зараженных клеток при 2500 g в течение|
|45 минут. |
|4. Отмывка клеток питательной средой. |
|5. Добавление к клеткам ростовой среды, содержащей |
|циклогексимид. |
|6. Инкубирование клеток в течение двух суток при +36 ° С. |
|7. Обнаружение хламидий в клетках методом прямой |
|иммунофлюоресценции или ПЦР. |
|Реальный срок получения результатов этим методом - семь |
|дней. |
| |
|В настоящее время в литературе растет число сообщений о |
|случаях резистентности хламидий к антибактериальным |
|препаратам (эритромицину, тетрациклину, доксициклину, |
|фторхинолонам). Ценность культурального метода состоит в |
|том, что он является пока единственным методом, позволяющим|
|выбрать антибактериальный препарат для лечения хламидийной |
|инфекции и оценить эффективность антибактериальной терапии.|
|Схема метода выявления устойчивости хламидий трахоматис к |
|антибактериальным препаратам |
|-Хламидийным изолятом, выделенным от больного при посеве, |
|заражают чувствительные клетки. |
|-К зараженным клеткам добавляют ростовую среду, содержащую |
|антибиотик. |
|-Зараженные клетки инкубируют 5 дней при температуре + 36 °|
|С. |
|-Чувствительность хламидий к антибиотику определяется по |
|подавлению инфекции в зараженных клетках. Процедура |
|длительная, занимает по времени две недели. |
|Диагностика Chlamydia trachomatis методом полимеразной |
|цепной реакции |
|Дороговизна, длительность и трудоемкость |
|микробиологического выделения хламидий в культуре |
|существенно затрудняет использование этой процедуры в |
|рутинной лабораторной диагностике. В литературе накоплен |
|обширный клинико-лабораторный опыт по использованию метода |
|ПЦР для выявления хламидий трахоматис. Особое внимание при |
|его использовании следует уделять, без сомнения, вопросам |
|правильной интерпретации получаемых результатов. |
|Экстремально высокие показатели чувствительности и |
|специфичности ПЦР делают эту методику во многом |
|революционной в лабораторной диагностике. Основными |
|мишенями при выявлении хламидий трахоматис являются |
|нуклеотидная последовательность видоспецифической |
|криптической плазмиды, последовательность главного белка |
|внутренней мембраны, рибосомальные гены. |
|Данная реакция представляет собой многократно повторяющиеся|
|циклы синтеза (амплификацию) специфической области |
|ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, |
|дезоксинуклеотидтрифосфатов, соответствующего солевого |
|буфера и олигонуклеотидных затравок-праймеров, определяющих|
|границы амплифицируемого участка. Каждый цикл состоит из |
|трех стадий с различными температурными режимами. На первой|
|стадии при 94 ° С происходит разделение цепей ДНК, затем |
|при 56-58 ° С - присоединение (отжиг) праймеров к |
|комплементарным последовательностям на ДНК-мишени, и при |
|температуре 72 ° С протекает синтез новых цепей ДНК путем |
|достраивания цепей праймеров в направлении 5’ –3’ . В |
|каждом цикле происходит удвоение числа копий |
|амплифицируемого участка, что позволяет за 25-40 циклов |
|наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой выбранных |
|праймеров, в количестве, достаточном для ее детекции с |
|помощью электрофореза или альтернативными ему технологиями |
|По сравнению с широко применяющимися иммунологическими |
|тестами ПЦР-диагностика обладает рядом преимуществ: |
|-высокой и регулируемой специфичностью, обусловленной лишь |
|нуклеотидной последовательностью, применяемой в данной |
|диагностической системе; |
|-высокой чувствительностью, позволяющей диагносцировать не |
|только острые, но и латентные инфекции (возможно выявление |
|даже единичных бактерий или вирусов); |
|-химическое сходство всех нуклеиновых кислот позволяет |
|разрабатывать универсальные процедуры для выявления |
|различных инфекционных агентов, |
|-возможностью идентификации возбудителя в течении 4,5-5 |
|часов. |
|Доставка биоматериала в ПЦР-лабораторию производится в |
|холодовом термоконтейнере или термосе со льдом. Важной |
|отличительной особенностью ПЦР-диагностики является |
|относительно низкая стоимость оборудования для проведения |
|анализа, сочетающаяся с универсальностью метода, что |
|позволяет выявлять весь спектр клинически актуальных |
|инфекционных агентов. |
|ПЦР-лаборатория должна быть разделена на зоны (комнаты). |
|Следует иметь не менее двух комнат |
|-пре-ПЦР-помещение, где проводится обработка клинических |
|образцов, выделение ДНК, приготовление реакционной смеси |
|для ПЦР и постановка ПЦР (при наличии условий два последних|
|этапа рекомендуется также проводить в дополнительном |
|отдельном помещении), в этих помещениях запрещается |
|проводить все другие виды работ с инфекционными агентами |
|(микробиологический анализ, ИФА, другие диагностические |
|тесты), ПЦР-диагностика которых проводится в данной |
|лаборатории. |
|-пост-ПЦР-помещение, где проводится детекция продуктов |
|амплификации, в ПЦР-помещении допускается использовать |
|другие методы детекции инфекций, диагностика которых |
|проводится в данной лаборатории. Комнату детекции продуктов|
|амплификации (пост-ПЦР-помещение) следует располагать как |
|можно дальше от пре-ПЦР-помещений. Следует исключить |
|движение воздушного потока из пост-ПЦР-помещения в |
|пре-ПЦР-помещение. |
|В комнате приготовления реакционной смеси и в комнате |
|обработки клинических образцов должны быть установлены |
|ультрафиолетовые лампы, рабочие поверхности в лаборатории |
|должны обрабатываться дезинфицирующими растворами . |
|Показания для диагностики С. trachomatis методом ПЦР |
|1. Острая фаза заболевания |
|2. Хроническая фаза заболевания |
|3. Установление этиологии хронического инфекционного |
|процесса урогенитального тракта. |
|4. Беременность с отягощенным акушерским анамнезом. 5 |
|Бесплодие неясного генеза. |
|6. Контроль эффективности проведенного антибактериального |
|лечения. |
|В случае выявления фрагмента ДНК хламидии трахоматис после |
|курса химиотерапии следует провести культуральную |
|диагностику для исключения “ложноположительного с |
|клинической точки зрения результата”. Если проведение |
|культуральной диагностики невозможно, то необходимо через |
|5-6 недель (полное обновление эпителиального покрова |
|мочеполовых путей) провести повторное исследование методом |
|ПЦР. |
|7. Выявление хламидии у ВИЧ-инфицированных лиц, больных |
|туберкулезом, вирусным гепатитом и со вторичными |
|иммунодефицитными состояними (онкологические больные после |
|курсов химио- и лучевой терапии, трансплантации костного |
|мозга, получающие иммуносупрессивную терапию). |
Страницы: 1, 2, 3
