что указывало на незначительное прямое окисление карбоксильной группы
биотина. О распределении меченого биотина в различных клеточных фракциям
можно судить по табл.
Содержание биотина в клеточных фракциях печени нормальных крыс
(Dakshinamurti, Misfry, 1963)
| |Нормальные животные |Авитаминозные |
|Фракция печени | |животные |
| |Общий |Связанный |Общий биотин (в|
| |биотин в|биотин в % |%) |
| |% |к общему | |
|Гомогенат |100 |92 |100 |
|Ядра |37 |99 |75 |
|Митохондрии |9 |89 |13 |
|Микросомы |2 |23 |о |
|Надосадочная жидкость |47 |91 |о |
Из таблицы видно, что 40—50% радиоактивности обнаружено в надосадочной
фракции, полученной после центрифугирования гомогената печени крыс. В
микросомах содержится незначительное количество витамина. Большая часть
биотина в различных клеточных фракциях, за исключением микросом,
присутствует в связанной с белком форме. Имеются и противоречивые данные о
том, что большая часть биотина (более 60%) содержится в митохондриях печени
животных и около 11%— в микросомах.
В настоящее время недостаточно исследована динамика содержания биотина в
тканях в онтогенезе животных. По-видимому, яйцо и зародыш в начальной
стадии развития наиболее богаты биотином. Развитие зародыша сопровождается
снижением содержания биотина в тканях. Исключение составляют печень и
почки, в которых содержание биотина значительно повышается в первые дни
постэмбрионального развития.
6. Участие биотина в обмене веществ и механизм действия
К 1958—1959 гг. накопились данные, которые указывали на участие биотина в
реакциях карбоксилирования. Установлено, что при биотиновой недостаточности
нарушаются следующие функции печени животных:
синтез цитруллина из орнитина, МН3 и С02, включение CО2 в пурины,
карбоксилирование пропионовой кислоты, приводящее к образованию янтарной
кислоты, включение С02 в ацетоуксусную кислоту. Однако механизм действия
биотина в этих реакциях оставался невыясненным. Данные опытов с 2-C14-
биoтинoм исключали возможность того, что С-атом уреидной группировки
биотина переносится в качестве остатка угольной кислоты. Одним из
обстоятельств, из-за которых подвергалась сомнению функция этого витамина
как кофермента карбоксилирования, было (описанное в разное время) участие
биотина в реакциях, в которых не происходило ни включения, ни отщепления
С02. Так, было обнаружено влияние биотина на дезаминирование аспарагиновой
кислоты, серина и треонина и участие его в синтезе жирных кислот. Первые
четкие доказательства коферментной функции биотина в реакции
карбоксилирования появились в работах, посвященных именно синтезу жирных
кислот. В этих работах отмечалось, что биотин является коферментом ацетил-
КоА-карбоксилазы, фермента, осуществляющего карбоксилирование ацетил-КоА с
образованием малонил-КоА—первую стадию синтеза жирных кислот (Wakil, 1958).
К этому времени были получены доказательства существования еще одного
биотинфермента, а именно (З-метил-кротонил-КоА-карбоксилазы (Lynen, Knappe,
1959). Все известные в настоящее время биотиновые ферменты катализируют два
типа реакций:
1. Реакции карбоксилирования или фиксации С02, сопряженные с расщеплением
АТФ и протекающие согласно уравнению:
АТФ + НСОз + RH[pic]R—СОО- + АДФ + Фнеорг.
|Реакции |Источник фермента |
|Ацетил-КоА + С02+ АТФ[pic]Малонил-КоА + АДФ + Ф |Печень голубя |
|Я-Метилкротонил-КоА + С02 + АТФ[pic] | |
|[pic]Я -Метилглютаконил-КоА+ АДФ + Ф |Микробактерии |
|Пропионил-КоА + С02 + АТФ[pic] | |
|[pic]Метилмалонил-КоА + АДФ + Ф |Сердце и печень |
| |свиньи |
|Бутирил-КоА+С02 + АТФ[pic] Этилмалонил-КоА+АДФ+ Ф |Мышцы и печень |
| |голубя |
|Пируват + С02+ АТФ[pic]Щавелевоуксусная кислота |Печень голубя |
II. Реакции транскарбоксилирования, протекающие без распада АТФ, при
которых карбоксилирование одного субстрата осуществляется при одновременно
протекающем декарбоксилировании другого соединения:
R1—COO- + R2H[pic] R1H + R2— COO-
Поскольку все приведенные реакции являются обратимыми, возможен
обратимый биосинтез АТФ. Во всех этих случаях имеет место включение С02 в
реактивное ?-подожение ацил-КоА или винилгомоло-гичное ему положение (при
карбо^силировании ?-метилкротонил-КоА).
К началу 60-х год5В были выделены и изучены карбоксилазы, осуществляющие
указанные превращения —В 1960 г. установлено участие биотина в реакции
транскарбоксилирования при исследовании синтеза пропионовои кислоты
СНз—СН—СО~S—КоА + СНз—СО—СООН [pic]
СООН
[pic] СНз-СНа—СО~S-КоА + НООС-СН2—СО—СООН
Биотиновые ферменты представляют собой олигомеры с большим молекулярным
весом (порядка 700000) и, как правило, содержат 4 моля связанного биотина
на 1 моль фермента, поэтому кажется вероятным, что они состоят из 4
субъединиц с молекулярным весом 175000, каждая из которых содержит одну
молекулу биотина.
В работах Lynen (1964) расшифрован механизм участия биотина в реакциях
карбексилирования. Установлено, что реакции карбоксилирования являются
двухстадийными. Первая стадия сводится к образованию «активной С02» в форме
С02~биотинфермента:
АТФ + Н С0-2+ биотинфермент [pic]АДФ + Фнеорг. + С02~биотинфермент.
Вторая стадия заключается в переносе «активной С02» на акцептор:
С02~биотинфермент + R2H [pic]биотинфермент + R2— С00-
Аналогичный двух стадийный механизм предложен и для реакций
транскарбоксилирования:
R1 —С00- + биотинфермент [pic]С02 ~биотинфермент R2H;
С02~биотинфермент + R2H[pic]R2— С00- + биотинфермент.
После установления существования «активной С02» в виде С02~биотинфермента
установлен характер связи между С02 и биотином. Этому способствовало
открытие того факта, что ?-метилкротонил-КоА-карбоксилаза способна
карбоксилировать свободный биотин, переводя его в карбоксибиотин. В
дальнейшем меченый карбоксибиотип был выделен в опытах с С14-бикарбонатом и
идентифицирован как Г-М-карбоксибиотин. Его структура была подтверждена
химическим синтезом. К атому времени уже было известно, что в биотиновых
ферментах карбоксильная группа биотина соединена с ?-NH2-группой лизина
ферментного белка ковалентной связью. На основании этих данных предложена
структура С02~биотинфермента.
[pic]
Эта структура получила ряд экспериментальных подтверждений и в
настоящее время является общепринятой для всех биотиновых ферментов.
Реакционная способность углекислоты, связанной с биотином, находит
выражение в энергетических взаимоотношениях. Величина свободной энергии
распада С02~биотинфермента равна 4,74 ккал/моль, что дает основание
причислить С02~биотинфермента к «богатым энергией» соединениям.
Исключительно большой интерес представляет совершенно неизученная
проблема регуляции активности биотинсодержащих ферментов и организме. В
этой связи особенно важны исследования по биосинтезу молекулы биотина и
образованию холоферментов из биотина и соответствующего ферментного белка.
Данные по первому вопросу изложены в разделе «Биосинтез». Что касается
образования холофермента, то можно считать установленным, что во всех
биотиновых ферментах био-тнн связан с ?-аминогруппой лизина. Этот способ
связи экспериментально доказан почти для всех карбоксилаз и метилмалонил-
КоА-оксалоаце-таттранскарбоксилазы. Недостаточные по биотину клетки
Propionibacterium shcemanii содержат апофермент и специфическую синтетазу,
которая катализирует при использовании АТФ соединение биотина с
апоферментом, приводящее к образованию активного холофермента
траискарбокснлазы. Необходимыми кофакторами этой реакции являются АТФ и
Mg2+. При использовании очищенных ферментов удалось доказать, что
образование холотранскарбоксилазы происходит в два этапа, причем
промежуточным соединением является биотиниладенилат (R-CO-5'-AMФ):
Mg2+
I. АТФ + R— С02Н + синтетаза[pic]R-СО-5’- АМФ - синтетаза + пирофосфат
(биотин
II. R-СО-5’- АМФ - синтетаза + Н2М-фермент R-CO-NH-фермент +
+5’-AMФ+cинтeтaзa.
Синтетический биотиниладенилат обладает способностью заменить смесь АТФ,
MgCl и биотина при синтезе холофермента (Lynen, 1964). Позже было
установлено, что образование других холоферментов протекает аналогичным
образом. Все известные ферментативные реакции, для которых установлено
участие биотина в качестве кофермента, являются процессами переноса
углекислоты. По-видимому, в обратимом присоединении и отдаче СО; и состоит
исключительная функция этого витамина в обмене веществ. Однако при
биотиновой недостаточности нарушаются очень многие реакции обмена в
интактном организме. Так, - биотин вовлечен в биосинтез белков,
дезаминирование аспартата, серина и треонина у бактерий, обмен триптофана,
жиров и углеводов, синтез пуринов, образование мочевины у животных и др.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8
