способность переносить кислород.
Присоединение кислорода меняет кислотно-основные свойства гемоглобина.
Оксигемоглобин является более сильной кислотой, чем дезоксигемоглобин.
Поэтому в тканях, где значительная часть гемоглобина теряет кислород и
становится более сильным основанием, гемоглобин связывает образующуюся в
ходе метаболических внутриклеточных процессов углекислоту. В альвеолах
легких дезоксигемоглобин снова превращается в оксигемоглобин, становится
более сильной кислотой и способствует отщеплению СО2. Это слегка упрощенное
описание важного процесса транспорта углекислоты эритроцитами. Углекислота,
освобождаемая тканями, недостаточно хорошо растворима для эффективного
переноса. С помощью фермента карбоангидразы, ускоряющего прямую и обратную
реакцию
СО2+Н2О(НСО3(+Н+ (8)
двуокись углерода превращается в хорошо растворимый бикарбонат-анион. В
капиллярах тканей отщепление кислорода повышает содержание
дезоксигемоглобина, связывающего протоны и смещающего, таким образом,
равновесие реакции (8) вправо. Легко растворимый ион бикарбоната
переносится кровью. В альвеолах легких гемоглобин оксигенируется, протоны
освобождаются и равновесие (8) смещается влево. Образуется плохо
растворимая двуокись углерода СО2, которая удаляется из водной фазы и
выдыхается. Таким образом, гемоглобин работает как буфер с переменным
значением pK. Функция гемоглобина как переносчика углекислоты не менее
важна, чем его функция переносчика кислорода.
Гемоглобин – одно из наиболее хорошо изученных белков. Десятки лет
исследований гемоглобина в описании и понимании физических, химических и
биологических аспектов его функционирования. Огромный вклад внесли работы
Макса Перутца и его сотрудников в Кавендишской лаборатории (Кембридж,
Великобритания). Однако важность этих работ касается не только гемоглобина.
Они послужили основой развития современных представлений о механизмах
ферментативного катализа, связав непосредственно кинетику и термодинамику
биохимических реакций с динамикой конформационных изменений макромолекул
белка. Если отвлечься от непосредственной практической пользы полученных
результатов для медицины, фармакологии, то фундаментальное значение работ
по изучению механизма функционирования гемоглобина заключается в
стимулировании прогресса в установлении законов протекания важнейших
процессов: ферментативного катализа и внутриклеточной трансформации энергии
в биологических системах. [2]
Об участии гемоглобина в мембранной организации эритроцитов
свидетельствует феномен образования серповидной и других форм эритроцитов
при различных гемоглобинопатиях, первооснову которого и составляет
аномальное взаимодействие эритроцитарной мембраны с мутантными
гемоглобинами. Не исключено, что изменение упруго-механических свойств
эритроцитарных мемран при повышении отрицательного заряда их внешней
поверхности происходит вследствие улучшения условий для создания и
структурирования белкового слоя, формируемого с участием гемоглобина на
внутренней поверхности эритроцитарных мембран. [13]
Показано, что при получении безгемоглобиновых теней эритроцитов в
препаратах электронно-микроскопически обнаруживается большое количество
везикул диаметром примерно 100 нм, что свидетельствует о частичной
фрагментации плазматической мембраны эритроцитов. В то же время если в
мембранах содержится много гемоглобина и других белков, обнаруживаемых в
примембранных слоях, то фрагментации мембраны определяемой таким образом,
не наблюдается. Имеются и другие доказательства стабилизирующего действия
гемоглобина на эритроцитарные мембраны. Например, S.Knutton и соавторам
удалось получить две фракции эритроцитарных мембран, различающихся
содержанием связанного с ними гемоглобина. Ими было показано, что во
фракции эритроцитарных мембран с большим содержанием гемоглобина разрушение
липопротеиновой структуры мембран при их дегидротации происходит намного
слабее, чем в случае с фракцией эритроцитарных мембран с малым содержанием
гемоглобина. В основе изменения условий для структурирования белково-
образующего примембранного слоя внутри эритроцитов может лежать изменение
электрических поверхностных свойств на внешней стороне. Это возможно
вследствие того, что для мембран в липидной зоне дебаевский радиус
экранировки зарядов гораздо больше ее толщины, в результате поверхностные
заряды с обеих сторон эритроцитарных мембран взаимно влияют друг на друга,
образуя самосогласованную систему. Кроме того, условия для образования
белкового слоя, стабилизирующего мембраны эритроцитов, могут изменяться и в
результате защелачивания их внутренней среды, что имеет место при
суспендировании эритроцитов в щелочной или неэлектролитной среде, например,
сахарозной. Это может способствовать гемоглобину и другим примембранным
белкам за счет изменения их свойств образовывать прочный примембранный
белковый слой (в отношении гемоглобина, например, известно, что его
свойства, в том числе кислородосвязывающие, сильно изменяются при
варьировании рН). Вместе с тем защелачивание внутренней среды эритроцитов
не всегда может служить фактором, стабилизирующим их структуру. В
литературе, например, утверждают, что для эритроцитов новорожденного
теленка, для которых характерно наличие фетального гемоглобина, любые
экспериментальные манипуляции, результатом которых является внутриклеточное
защелачивание среды, вызывают их самопроизвольный гемолиз. По мере развития
организма теленка (2-3 месяца жизни) эритроциты с нормальным гемоглобином,
появляющиеся взамен вытесняемых из кровеносного русла клеток, содержащих
фетальный гемоглобин, становятся устойчивыми к внутриклеточному
защелачиванию их среды. При этом важно отметить, что, по данным литературы,
в гемолизе фетальных эритроцитов при защелачивании их внутренней среды,
помимо фетального гемоглобина, определенная роль принадлежит и мембранному
белку band III. [13]
Приведенные литературные данные дают основание сделать вывод о тесной
взаимосвязи процессов метаболизма, трансмембранного транспорта, изменений
формы и механических свойств эритроцита, что, по-видимому, позволяет
организму осуществлять координированную регуляцию функционирования клетки
через соответствующие рецепторные структуры, имеющиеся на наружной
поверхности мембраны. [9]
Таким образом, в поддержании структурной целостности эритроцитов важное
значение имеют внутренние примембранные белковые слои, структура и
взаимодействие которых с эритроцитарными мембранами взаимно обусловлены и в
целом представляют собой единую структурную организацию. Поэтому всякая
модификация как самой мембраны, так и содержащегося в них гемоглобина в
конечном счете сопровождается и модификацией этой особой организации,
частным примером проявления которой может быть изменение ее механических
свойств. [13] Приведенные данные побудили нас провести исследование с целью
оценки количественного содержания мембрансвязанного гемоглобина эритроцитов
человека и его связи со структурными белками.
материал и методы исследования
Материал исследования
Материалом настоящего исследования послужили эритроциты 124 практически
здоровых лиц, проживающих в городе Курске, в возрасте от 18 до 47 лет.
Набор добровольцев проводился при исключении любой соматопатологии.
У обследуемых проводился забор крови из локтевой вены в сухую стерильную
посуду в количестве 5-7 мл с целью получения образов эритроцитарных
мембран.
Методы исследования
Для достижения поставленной цели и решения задач настоящей работы
использовался комплекс методов.
Биохимические методы.
Реактивы и биоматериалы. В работе использовались: декстран Т-500 фирмы
"SIGMA" (США), HBS – целлюлоза фирмы "SIGMA" (США), гидрофосфат натрия,
хлористый натрий, мочевина фирмы "Bio-Rad" (США), трис, 2 – меркаптоэтанол,
персульфат аммония "Reanal" (Венгрия), додецилсульфат натрия (ДДС) фирмы
"Диа-Фарм" (Россия), акриламид "SIGMA" (США), N,N( - метилен бисакриламид
"FLUKA" (Швейцария), кумасси G – 250 фирмы "Serva" (ФРГ), бромфеноловый
синий, ТЕМЕД, глицин, набор белков для определения молекулярного веса MS-2
(Россия).
Реактивы отечественного производства были марки "ХЧ" и "ОСЧ".
Получение эритроцитов. Эритроциты получали из 5 мл гепаринизированной
крови по методу Бейтлера с незначительной модификацией. [14] Сначала
гепаринизированную кровь отстаивали дважды в растворе PBS, содержащем 3%
декстран Т –500, в течение 30 минут. Затем эритроцитарную массу подвергали
дополнительной очистке, пропуская ее через колонку с HBS-целлюлозой, после
чего эритроциты ценрифугировали при 3000 оборотах в минуту. Далее из
полученной очищенной массы эритроцитов проводили выделение мембран.
Выделение мембран. Для получения препаратов мембран эритроциты разрушали
осмотическим шоком по методу Dodge с небольшой модификацией, заключавшейся
в том, что гемолиз эритроцитов и отмывку "теней" проводили двукратно в 10
мМ Na – фосфатном буфере с добавлением ингибитора протеназ PMSF. После
этого мембраны эритроцитов лиофилизировали и хранили при -20(С.
Одномерный электрофорез по Лэммли. Электрофорез в присутствии ДДС
проводили модифицированным методом методом Лэммли. [14] Для этой цели
использовали следующие растворы:
1. 60% акриламид –0,8% метилен бисакриламид.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6
