электрической плитке и прокаливали в муфельной печи. Затем золу
обрабатывали 1% раствором хлороводородной кислоты, фильтровали, осадок на
фильтре промывали 1% раствором хлороводородной кислоты и растворяли в 5%
растворе гидроксида калия. С раствором силиката калия проводили реакцию с
10% подкисленным раствором молибдата аммония, приготовленного следующим
образом: к 90 мл 11% раствора молибдата аммония прибавляли 10 мл 50 %
раствора серной кислоты.
К 1 мл полученного раствора силиката калия прибавляли 2 мл 10%
подкисленного раствора молибдата аммония, должно образоваться желтое
окрашивание, при добавлении нескольких кристалликов аскорбиновой кислоты
желтая окраска должна переходить в интенсивно синий цвет.
8 Обнаружение эфирных масел.
Использовался метод перегонки водяным паром. Навеску измельченного
сырья помещают в широкогорлую круглодонную колбу вместимостью 700-800 мл,
приливают 300 мл воды и закрывают резиновой пробкой с обратным
холодильником. В пробке снизу укрепляются металлические крючки, на которые
при помощи тонкой проволоки подвешивают градуированный приемник так , чтобы
конец холодильника находился точно над воронкообразным расширением
приемника, не касаясь его. Колбу с содержимым нагревают до кипения и слабо
кипятят.
Пары воды и эфирного масла конденсируются в холодильнике и жидкость
стекает в приемник. Масло отстаивают в градуированном колене приемника, а
вода через меньшее колено приемника вытекает обратно в колбу.
9 Обнаружение сесквитерпеновых лактонов.
50 мл водного извлечения (1:10) помещали в делительную воронку,
добавляли 10 мл хлороформа и осторожно взбалтывали, затем хлороформное
извлечение сливали в колбу. К этому же водному извлечению добавляли свежую
порцию хлороформа, второе извлечение объединяли с первым. Затем хлороформ
отгоняли под тягой до получения «смолки».
ИК-спектр снимали на спектрофотометре «Specord UR» с призмами Li F и
NaCl в таблетках KBr высотой 1 мм при соотношении веществ, наполнителя
1:400 и в пленке.
6. Количественное определение флавоноидов
Около 1,0 г сырья помещали в колбу с притертой пробкой на 50 мл,
заливали 20 мл 90% этанола с содержанием 2%-тов концентрированной
хлороводородной кислоты, экстрагировали с обратным холодильником на кипящей
водяной бане и декантировали в мерную колбу на 50 мл. Извлечение повторяли
еще дважды, заливая по 10 мл 90% подкисленного этанола. Объединенное
извлечение доводят до метки 90% этанолом.
0,2 мл экстракта наносили на полоску хроматографической бумаги размером
45(15 см и хроматографировали в системе 0,1 М хлороводородной кислоты.
Хроматограмму высушивали, в УФ-свете отмечали пятна флавоноидов, вырезали и
элюировали 96% этанолом три раза по 10, 5 и 5 мл в колбе спритертой пробкой
с обратным холодильником на водяной бане. Полученное извлечение флавоноидов
сливали в мерную колбу на 25 мл, доводили до метки 96% этанолом и снимали
оптическую плотность элюятов с помощью спектрофотометра с толщиной слоя 1
см при длине волны 353нм.
Сумму флавоноидов пересчитывали на кверцетин (Е =387,5) поформуле:
C= Д*У1*К*У2*100/(Е *I*М*(100-В)*У3,где
Д- оптическая плотность
У1- объем первого извлечения, мл (50 мл)
У2- объем второго извлечения, мл (25мл)
У3- объем, пошедший на хроматографирование, мл (0,2 мл)
Е -удельный показатель поглощения
М- масса навески, г
В- влажность сырья, %
I- толщина слоя, см
К-поправочный коэффициент на неполное элюирование с бумаги (1,15)
7. Количественное определение соединений кремния
В предварительно прокаленный фарфоровый тигльпомещали около 1,0 г
сырья, сжигали и прокаливали в муфельной печи при температуре не выше 560-
650 (С до постоянной массы (3-5 часов).
После охлаждения золу количественно переносили в стакан емкостью 150
мл, добавляли 50 мл 5% раствора хлороводородной кислоты и нагревали на
кипящей водяной бане в течение 20 мин. Полученный раствор отфильтровывали
через рыхлый беззольный фильтр, осадок промывали 1% раствором
хлороводородной кислоты.
Фильтр с осадком переносили в коническую колбу на 150 мл, добавляли 50
мл 5% раствора гидроксида калия, затем прикрыв часовым стеклом, нагревали
до кипения и кмпятили в течение 20 мин (колбу перед нагреванием взвесили).
После охлаждения содержимое колбы доводили до первоначальной массы 5%
раствором гидроксида калия.
1 мл полученного фильтрата помещали в мерную колбу на 25 мл, прибавляли
2 мл 5% раствора серной кислоты, доводили водой до метки. Через 15 мин
определяли оптическую плотность с помощью фотоэлектроколориметра в кювете с
толщиной слоя 10 мм при длине волны 400 нм, используя в качестве раствора
сравнеия фильтрат без добавления реактивов.
8. Методика определения экстрактивных веществ.
20 г сырья измельчали и просеивали сквозь сито с отверстиями диаметром
1мм, помещали в коническую колбу прилив растворителя до «зеркала». Колбу
закрывали пробкой, взвешивали и оставляли на 16 часов. Затем содержимое
тщательно взбалтывали и фильтровали через сухой фильтр в сухую колбу.
Фильтрат переносили в фарфоровую чашку диаметром 7-9 см, предварительно
высушенную при t( +100(C до постоянной массы и взвешенную на
аналитических весах. Фильтрат выпаривают на водяной бане досуха, и сушат
при t( 100-105(С в течении 3 часов, охлаждали в эксикаторе и взвешивали.
9. Определение микроэлементного состава.
Для определения минерального состава травы хвоща использовался рентгено-
флуоресцентный метод.
В чашку (тигль) берут навеску измельченного продукта (пробы взвешивают
с погрешностью не более + 0,01 г), помещают в сушильный шкаф и высушивают
при температуре около +105(С.
Содержимое чаши смачивают 2-3 мл 32% раствором азотной кислоты и
нагревают на водяной бане до прекращения выделения паров. Обработку азотной
кислотой повторяют еще дважды. Затем чашу помещают на электроплитку и
проводят обугливание до прекращения выделения дыма, потом чашу переносят в
электропечь при температуре около +250(С. Минерализацию проводят,
постепенно повышая температуру электропечи на +50(С через каждые 30 мин и,
доведя ее до температуры +450(С, продолжают минерализацию при этих условиях
до получения золы. Чашу с золой извлекают из электропечи, охлаждают до
комнатной температуры и смачивают золу 0,5-1,0 мл 32% раствором азотной
кислоты. Затем кислоту досуха выпаривают на электроплитке со слабым
нагревом и снова помещают чашу с пробой в электропечь при температуре,
постепенно доводя температуру до 450(С и выдерживают 1 час. Минерализацию
считают законченной, когда зола станет белого или слегка окрашенного цвета,
без обугленных частиц. При наличии обугленных частиц повторяют обработку
золы раствором азотной кислоты или водой.
В чашу с золой добавляют 10 мл 32% раствора азотной кислоты, нагревают
на электроплитке со слабым нагревом до появления запахов азота. Содержимое
чаши фильтруют в стакан через фильтр «белая лента». Тщательно ополаскивают
чашу водой очищенной, фильтруя смыв чаши в тот же стакан. В фильтрат,
содержащий тяжелые металлы добавляют азотнокислый цирконил, нагревают,
фильтруют. Полученный осадок анализируют на приборе спектрометре
«Спектроскан».
10. Исследование антигрибковой активности
С целью изучения антигрибковых свойств БАВ хвоща полевого воздушно-
сухое сырье измельчали до размера частиц 2-5 мм, заливали до «зеркала»
экстрагентом (вода очищенная, этиловый спирт 70%, бутанол, хлороформ, эфир)
настаивали в течении 16 часов, фильтровали и полученные экстракты
высушивали в струе воздуха, нагретого до +30(С.
Антигрибковые свойства полученных экстрактов исследовали методом
двукратных серийных разведений в жидкой среде Сабуро по методике Вичкановой
С.А.. Состав среды Сабуро:
- 10,0 пептона,
- 40,0 мальтозы,
- воды очищенной до 1 л.
В качестве тест-культуры использовали штаммы Aspergillus niger
163/3685, Candida albicans 4337, Trichophiton rubrum ВКПГ248/700, T.
Mentagrophytes var. Interdigitale ВКПГ 268, Microsporum canis ВКПГ 326/316,
которые были получены в отделе микологии центрального кожно-
венерологического института Министерства здравоохранения России г. Москва.
Подготовка грибов-дерматофитов к опыту, посев и их учет проводили по
методу Г.Н. Першина. Для посева использовали суспензии как правило,
суточной агаровой культуры дрожжей, культуры плесневого гриба 4-5 суточные,
остальных дерматофитов 7-10 суточные. Взвеси грибов готовили в
физиологическом растворе по оптическому стандарту мутности.
После дополнительных разведений стандартного раствора микробная
нагрузка патогенных грибов составляла 1000 грибковых тел в 1 мл среды.
Посевы инкубировали в термостате, дрожжи при 37(С, остальные при 33(С.
Учет культуры дрожжей проводили через 24 часа, другие культуры на 7-10
сутки. Предельная доза препарата испытанная нами, соответствовала 1000
мкг/мл. Повторность каждого опыта 4-6 кратная. Контролем служили пробирки с
питательной средой, засеянные аналогичным количество тест-культуры, а также
пробирки со средой и препараты без культуры (для проверки мутности и
осаждения препарата).
За критерий антигрибковой активности препарата принимали
фунгистатический титр, который оценивали в микрограммах на 1 мл (мкг/мл)
питательной среды. За фунгистатический титр принимали предельную
концентрацию препарата в среде, при которой отсутствовал видимый рост
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8