посева на чашки с простым питательным агаром пятнами диаметром 5—10 мм.

После суточного инкубирования при 37° С полученные макроколонии проверяют в

реакции плазмоагглютинации, для чего микробную массу размешивают петлей на

стекле в каплях цитратной кроличьей или человеческой плазмы, разведенной 1

:4. Образование хлопьев учитывают в течение 30с—1 мин. При наличии

плазмоагглютинации такие штаммы считают подозрительными и отвивают на

скошенный агар для дальнейшего изучения в коагулазной реакции. При таком

отборе число пропускаемых штаммов патогенных стафилококков человеческого

происхождения невелико, культуры же, выделенные от животных, требуется

проверять в реакции плазмокоагуляции.

Коагулазная проба является основным признаком, определяющим

болезнетворность стафилококков, поэтому ее постановка требует к себе

максимального внимания. Для выявления коагулазной активности у

стафилококков, выделенных от людей, можно пользоваться как цельной кровью,

так и плазмой кроликов или человека. Можно использовать также кровь или

плазму, взятую непосредственно от человека. Консервированная плазма или

кровь, используемые для переливания, непригодны для реакции, так как к ним

часто добавляются консерванты, которые препятствуют жизнедеятельности

стафилококков, проявлению коагулазной активности. Не следует применять

кровь животных или людей, переносящих стафилококковые заболевания, в

особенности затяжные, так как она может оказаться нестерильной и содержать

антикоагулазу. При работе со стафилококками, выделенными от рогатого скота,

можно пользоваться бычьей кровью.

Асептично взятую кровь стабилизируют с помощью 1—4% цитрата или 0,1%

оксалата. Для получения плазмы нитратную кровь центрифугируют или

отстаивают на холоду. Но, как уже говорилось, можно пользоваться и цельной

кровью. Затем кровь разводят стерильным физиологическим раствором в

соотношении 1 : 3 или 1 : 5 и разливают по 0,2—0,3 мл в стерильные

пробирки, которые перед стерилизацией должны быть тщательно вымыты, так как

остатки химических веществ могут влиять на результат плазмокоагуляции.

Испытуемые агаровые культуры стафилококков вносят петлей в плазму и

хорошо перемешивают. Бульонные культуры вносят пипеткой в объеме 0,1 мл В

каждом опыте необходимо ставить контроль с культурами заведомо патогенных

стафилококков, дающих коагулазную реакцию, и штаммами коагулазоотрицатель-

ных микроорганизмов. Кроме того, часть пробирок с разлитой плазмой следует

оставлять не засеянной микробами и выдерживать в термостате на протяжении

всего срока опыта. В случае наступления коагуляции хотя бы в одной из них

весь опыт нужно переставить с новой порцией крови. Пробирки с исследуемыми

культурами выдерживают в термостате при 37 °С в течение суток. Учет

результатов проводится обязательно дважды: через 2—3 ч и 24 ч. Учитывают

свертывание плазмы и образование сгустков. Обычно культуры, активно

продуцирующие коагулазу, дают положительную реакцию уже через 2—3 ч. а если

они обладают и выраженной фибринолитической активностью, то первоначально

образовавшиеся сгустки могут подвергнуться расплавлению к концу суток.

Слабокоагулирующие штаммы могут давать положительную реакцию в поздние

сроки—к концу суток. Опыты, давшие сомнительный результат, необходимо

повторить.

Некоторые исследователи, получив отрицательный или сомнительный

результат, оставляют пробирки на столе. Этого делать нельзя, так как

свертывание плазмы в более поздние сроки может носить не специфический

характер и его не следует принимать во внимание.

Стафилококки, дающие положительную коагулазную пробу, должны

рассматриваться как потенциально патогенные, независимо от наличия или

отсутствия у них гемолитических свойств и характера пигмента, их относят к

виду St. aureus и в дальнейшем подвергают фаготипизации и проверке на

чувствительность к антибиотикам.

Углубленное изучение стафилококков показало, что основной признак па-

тогенности — коагулазная реакция может подвергаться изменчивости при

воздействии различных факторов (Г. Н. Чистович, 1961; Е. М. Падерина,

1966), поэтому в ряде случаев, при выделении коагулазонегативных

стафилококков в монокультуре из патологических очагов, целесообразно

изучить у них другие признаки потенциальной болезнетворности и прежде всего

— способность ферментировать маннит в анаэробных условиях. Известно, что

среди коагулазоотрицательных часть культур обладает способностью расщеплять

маннит в анаэробных условиях (8,4% —по данным А. А. Акатова и М. Л.

Хатеневер, 1974).

Определение ферментации маннита в анаэробных условиях технически очень

просто и осуществляется путем посева уколом исследуемых культур в пробирки

с высоким столбиком полужидкого агара Хоттннгера, содержащего 1% маннита и

0,004% индикатора бромкрезолпурпура или бромтимолблау (рН == 7,2). Эту

среду перед посевом «регенерируют», т. е. кипятят в водяной бане, быстро

охлаждают, а после посева заливают слоем стерильного вазелинового масла.

Посевы инкубируют при 37 °С в течение 5 дней. Однако в значительном числе

случаев результаты могут быть учтены уже через сутки.

Наряду с реакцией плазмокоагуляции, большое значение приобрела еще одна

важная способность стафилококков, характеризующая их потенциальную

патогенность, —дезоксирибонуклеазная активность. Многие исследователи

сообщают о высокой корреляции этого признака с коагулазной активностью и

токсигенностью изучаемых культур; отмечают, что стафилококки, выделенные из

патологического материала, как правило, обладают ДНК-азой. Коагула-

зопозитивные штаммы, полученные от носителей, могут не иметь этого

фермента, и обычно отсутствие дезоксирибонуклеазной активности сочетается с

низкой биохимической способностью и атоксигенностью таких культур

стафилококков.

По наблюдениям некоторых исследователей, среди коагулазонегативных

штаммов стафилококков, но обладавших другими признаками патогенности,

выделенных в ряде случаев от больных с различными гнойными инфекциями,

дезоксирибонуклеазную активность проявляли от 10 до 29% таких культур (И.

И. Панышева и сотр., 1967; Franklin и соавт., 1966; Lierd и Golde, 1970).

В настоящее время этот тест может служить надежным дифференциальным

признаком между патогенными и непатогенными стафилококками и в то же время

может помочь в дифференциации степени патогенности коагулазопозитивных

штаммов и, безусловно, привлечет внимание к коагулазонегативным, но

обладающим этим ферментом культурам стафилококков и в ряде случаев позволит

отнести последние к болезнетворным формам с большей уверенностью.

Методика определения дезоксирибонуклеазной активности несложна, в

основу ее положен метод Джеффриса. Готовят впрок 2% МПА (рН—8,6),

содержащий ДНК (2 мг/мл среды), разливают по флаконам и стерилизуют текучим

паром в течение 30 мин. Перед разливом в чашки к среде добавляют CaCIa (0,8

мг/мл). На подсушенную среду засевают суточные культуры стафилококков.

После инкубации в течение 18—20 ч при 37°, на поверхность среды наливают IN

раствор НС1 и через 7—10 мин учитывают зоны просветления, которые оценивают

крестами (Н. Б. Мордвинова и соавт., 1967).

Нами предложен более экономичный метод для обнаружения ДНК-азы у

микроорганизмов. Этот способ, помимо уменьшения в 2 раза расхода ДНК на

каждый опыт, позволяет использовать более дешевую низкополимерную

нуклеиновую кислоту, изготовляемую Олайнским заводом химических реактивов.

Предлагаемая методика широко апробирована на кафедре микробиологии ЛСГМИ и

по качеству результатов не уступает общепринятой. Поэтому мы приводим ее

подробное описание.

Для приготовления рабочего раствора ДНК, навеску нуклеиновой кислоты из

расчета 10 мг/мл помещают в дистиллированную воду, добавляют 0,5 мл 0,2%

(или 0,8%) раствора NaOH на каждые 10 мл воды. Для лучшего растворения ДНК

смесь либо нагревают до кипения в водяной бане при постоянном перемешивании

стеклянной палочкой, либо оставляют на ночь при 37 °С в термостате. К

расплавленному и остуженному до 50 °С МПА добавляют рабочий раствор ДНК из

расчета 1 мг/мл (на 9 мл МПА—1 мл раствора ДНК), перемешивают, разливают

по10л(л в пробирки, стерилизуют текучим паром в течение 30 мин или в

автоклаве при 0,5 атмосферы в течение 20 мин. Срок хранения— 1—2 мес.

При постановке опыта столбики агара с ДНК растапливают, в водяной бане

добавляют 0,1 мл официнального стерильного 10% р-ра СаСЬ, перемешивают и

выливают на слой хорошо подсушенного питательного агара в чашки Петри и

вновь подсушивают. Суточную агаровую культуру засевают маленькими бляшками

(диаметр равен 2—2,5 мм) или штампом-репликатором не более 20—25 бляшек, во

избежание слияния зон деполимеризации ДНК. После 18—20-часовой инкубации

поверхность агара заливают 5 мл IN раствора НС1 и через 3—5 мин учитывают

зоны просветления. Реакции оценивают в крестах.

При этом следует учесть, что интенсивность зоны деполимеризации на

плотной среде не всегда совпадает с количеством продукции этого фермента у

исследуемых стафилококков в жидких средах.

Для обнаружения фибринолизина используют несколько усовершенствованный

метод Кристи с сотр.

Среда Кристи—Чепмена имеет следующий состав: мясной экстракт—0,45 г,

пептон—0,75 г, хлористый натрий—1,2 г, агар—2,75 г, вода—130 мл, рН среды

== 7,0. Стерилизуется в автоклаве и сохраняется впрок.

Перед опытом среду растапливают, остужают до 50 °С и добавляют 15—20%

стерильной цитратной человеческой плазмы. Смесь прогревается в водяной бане

при 65—70°С в течение 2— 5 мин до появления ясной мути, а затем разливается

в чашки. Испытуемые культуры засевают «пятнами» по 15—20 на чашку.

Посевы инкубируют при 37 °С. Учитывается

образование зон просветления вокруг колонии первоначально через 14 ч, затем

через 24 и 48 ч, так как реакция у различных культур течет неодинаково

быстро и у ряда штаммов она развивается в более поздние сроки.

Фибринолитический тест мы считаем весьма пригодным для определения

потенциальной болезнетворности стафилококков, но оцениваем только в

комплексе с другими признаками активности.

Гиалуронидазная активность определяется по методу Мак-Клина в

модификации М. Ш. Могилевского и Л. С. Коган (1949).

Раствор гиалуроната дающий в присутствии 2 N уксусной кислоты типичный

сгусток, разливается по 0,5 мл в стерильные пробирки. Добавляется 0,5 мл

суточной культуры стафилококка в пептонной воде. Контролями служат:

гиалуропат + дистиллированная вода и гиалуропат + незасеянная среда. Смеси

встряхиваются и выдерживаются при 37 °С 15—20 мин. Затем в каждую пробирку

добавляется по две капли 2 N раствора уксусной кислоты и встряхивается. В

контролях должен образоваться слизистый комочек. В опыте при наличии

гиалуронидазы он отсутствует, что свидетельствует о деполимеризации

гиалуроновой кислоты микробным ферментом.

Для изучения токсигенности стафилококков удобно пользоваться методом,

предложенным Илеком и Леви (1950), позволяющим определить типы гемолизинов.

С этой целью готовятся чашки с питательным агаром, содержащим 5%

отмытых физиологическим раствором эритроцитов барана, кролика и человека.

На поверхность питательной среды по диаметру помещают стерильную

полоску фильтровальной бумаги, смоченную альфа-антитоксической сывороткой.

Отступив 1—2 мл от края полоски, перпендикулярно к ней засеивают штрихами

исследуемые культуры. Посевы инкубируют при 37 °С в течение суток, после

чего учитывают результаты.

Альфа-гемолиз проявляется в виде полного просветления среды вокруг

штриха культуры и нейтрализуется альфа-антитоксической сывороткой. Он

выявляется на средах с кроличьими и бараньими эритроцитами

Бета-гемолиз на агаре с бараньей кровью дает частичное просветление,

зона которого имеет буровато-пурпурный оттенок. Это «тепло-холодовый»

токсин и лучше выявляется после дополнительного суточного выдерживания

чашек в холодильнике при температуре +4 °С по характерному послойному

гемолизу бараньих эритроцитов и не централизуется альфа-антитоксической

сывороткой. На кроличьих эритроцитах он не активен. Дельта-гемолизин

определяется по узкой полоске гемолиза бараньих и кроличьих эритроцитов, не

нейтрализуется альфа-антитоксической сывороткой. Однако образование дельта-

гемоли-зина на этих чашках может быть замаскировано действием альфа-токсина

и поэтому его следует проверять на средах с эритроцитами человека или

лошади. Таким образом, для определения всех 3 типов гемолизинов достаточно

использовать эритроциты барана и человека или лошади.

Для определения вирулентности стафилококков существуют несколько

различных методов заражения белых мышей.

Наиболее простым является введение 0,1 мл суточной бульонной культуры

испытуемого стафилококка в хвостовую вену. Учет гибели животных

осуществляется в течение 10 суток, регистрируют наличие абсцессов в почках.

Удобно пользоваться способом Badenski и сотр. (1958), Суточная

бульонная культура центрифугируется при 3000 об/мин — 30 мин. Полученный

осадок ресуспендируется в половинном объеме декантата и в количестве 0,05

мл вводится 6 мышам позади глазного яблока в окологлазничную клетчатку.

Культуру, вызывающую гибель половины и более зараженных мышей в течение 6

дней, считают вирулентной.

При этих методах заражения вирулентной культурой у животных развивается

общин септический процесс с преимущественным поражением почек. Основная

гибель мышеи происходит на 3—5-й день после заражения.

Другие способы заражения белых мышей (внутрибрюшинный и интраназальный)

требуют в десятки

раз большей заражающей дозы, максимум гибели мышей приходится на 1—2-е

сутки, что характеризует преимущественно токсический компонент процесса (С.

А. Анатолий, И. И. Антоновская, 1967).

В то же время ряд исследователей отдают предпочтение более простому

технически внутрибрюшинному способу заражения мышей, который одновременно

позволяет изучать клеточные и гуморальные механизмы развития инфекции.

Сопоставление вирулентности стафилококков для белых мышей с отдельными

факторами их патогенности показало, что вирулентность штаммов, по данным

большого числа исследователей, коррелирует с уровнем альфа-гемотоксина. Что

касается других признаков патогенности и их корреляции с вирулентностью, то

получены разноречивые сведения. Так, по данным С. А. Анатолия (1969),

вирулентность штаммов коррелировала с продукцией бета-гемолизина,

летального фактора, лецитовителлазы, гиалуронидазы и коагулазы. А. К.

Акатов (1968) не отмечает корреляции вирулентности с коагулазной,

лециговител-лазной, фибринолитической активностью, не установлена

корреляция с дельта-токсигенностью.

Для сравнения вирулентности стафилококковых культур можно использовать

их способность вызывать дермонекротическую реакцию у кроликов.

Готовят 4-миллиардную взвесь суточной агаровой культуры стафилококка в

физиологическом растворе, а из полученной густоты делают разведения, чтобы

получить 2- и 1-миллиардные взвеси. Из каждого разведения в объеме 0,1 мл,

что составляет 100, 200, 400 миллионов микробных тел, вводят кролику в

выстриженную или депилированную накануне кожу. На одном кролике можно

одновременно поставить до 8 внутрикожных проб. Ежедневно отмечают

проявления дермонекротической реакции, а окончательно на 4-е сутки. За

минимальную дермонекротическую дозу принимают то наименьшее количество

культуры, которое дает некроз на 4-е сутки (Г. В. Выгодчиков, 1963).

Список использованной литературы

1. А.М.Смирнова, А.А.Трояшкин, Е.М.Падерина: микробиология и

профилактика стафилококковых инфекций – «Медицина», 1977.

2. Стафилококковые инфекции: российский сб. науч. тр. – С.-П., 1991.

3. А.М.Смирнова: вопросы иммунологии и микробиологии стафилококковых и

стрептококковых инфекций – Ленинград, 1975.

4. Лекция по теме.

5. Методическая разработка кафедры.

Страницы: 1, 2