2.3. Иммиджеры
Очень полезной и эффективной оказалась "электронная авторадиография", возникшая сравнительно недавно, как результат развития микроэлектроники и компьютерной техники.
Фосфоимиджер -- прибор для "электронной авторадиографии" фосфора-32. Кассета с многократно используемым экраном экспонируется с плоским образцом: гелем, хроматографической пластинкой и т.п. Затем экран помещается в прибор, в котором с помощью лазерного сканирования определяется местоположение и активность радиоактивного материала, экспонировавшегося с экраном.
Другая вариация на эту тему -- это использование газопроточных счетчиков для "электронной авторадиографии". Представьте себе щетку для одежды, каждый волосок которой диаметром 0,2 мм является индивидуальным газопроточным счетчиком. Если вы совместите такую "щетку" общим размером 18 х 24 см с исследуемым плоским образцом, то на экране компьютера в реальном времени вы сможете наблюдать количественную картинку распределения "радиоактивных веществ" на плоскости вашего образца. Разные модификации такого прибора позволяют работать практически со всеми радионуклидами, которые применяются в life science.
Эффективность счета в этих приборах, конечно, не может быть высокой, однако для практической работы в life science этот недостаток с лихвой компенсируется быстротой и удобством "электронной авторадиографии", а также возможностью получения результата сразу в электронном виде.
3. Классификация и номенклатура
Все радиоактивные источники с технологической точки зрения делятся на закрытые и открытые. Закрытые источники -- это радиоактивные препараты, помещенные в специальную защитную герметичную упаковку (как правило стальную), -- предназначены для работ без вскрытия защитной оболочки.
В молекулярно-биологических и биохимических исследованиях используют открытые источники -- твердые, жидкие или газообразные радиоактивные вещества или их растворы. Практически все радиоактивные препараты, применяемые в life science -- это растворы соединений, меченных радиоактивными изотопами.
Для обозначения конкретного изотопа (в том числе и радиоактивного), согласно правилам номенклатуры, перед химическим символом элемента ставится надстрочечное число, обозначающее массу изотопа. Например, 14С -- изотоп углерода с массой 14. В литературе допускается полное написание химического элемента и его массы через дефис, например, углерод-14. Обратите внимание, что пишется 14С, а произносится обычно С-14, т.е. для любого изотопа при написании первым всегда указывается массовое число изотопа над строкой, а затем символ химического элемента, а произносят наоборот: сначала элемент, затем масса изотопа.
Соединения, меченные радиоактивными изотопами, делят на две группы веществ. Во-первых, это конкретные химические соединения, у которых один атом (или несколько) заменён на атом радиоактивного изотопа того же элемента, т.е. химически такое соединение идентично "немеченому". Во-вторых, это молекулы соединений, модифицированные с помощью радиоактивного фрагмента (или дополнительного радиоактивного атома), которые отличаются от исходного немеченого соединения. К последнему случаю относятся всевозможные конъюгаты и модификации биологических макромолекул с неопределенным местоположением радиоактивного атома, например, молекула иммуноглобулина с введенным изотопом радиоактивного йода-125. Более подробно об этом ниже.
Для обозначения меченых соединений первой группы принято в обычное химическое наименование молекулы вставлять в квадратных скобках наименование изотопа, которым мечено соединение, и его место в молекуле перед названием части молекулы, содержащей меченый атом. В качестве примера ниже приведены наименования тимидин-5'-трифосфата, меченного различными радионуклидами и в разных положениях:
16. [6-3H] тимидин-5' трифосфат
17. [метил-3H] тимидин-5' трифосфат
18. [U-3H] тимидин-5' трифосфат
19. [5'-3H] тимидин-5' трифосфат
20. [6,2',3'-3H] тимидин-5' трифосфат
21. [2-14С] тимидин-5' трифосфат
22. [U-14С] тимидин-5' трифосфат
23. тимидин -5' [б-32P] трифосфат
24. тимидин -5' [г-32P] трифосфат
В примерах 3 и 7 место радиоактивного атома в молекуле обозначено U -- это означает, что точное место радиоактивного атома неизвестно и, возможно, речь идет о равномерно меченой молекуле. Обычно такое бывает, если способ получения соединения заключался в выращивании микроорганизма на среде, обогащённой целевым изотопом, с последующим выделением нужного соединения из клеточного лизата. Подробнее методы получения меченых соединений обсуждаются в других разделах. В примерах 8 и 9 б и г -- это не тип радиоактивного распада, а местоположение радиоактивных атомов фосфора-32 в трифосфатной группе.
Для наименования второй группы соединений обозначение радионуклида в квадратных скобках выносят перед наименованием молекулы: [125I]-альбумин -- альбумин, меченный йодом-125 или [метил -3H]-альбумин -- альбумин, меченный тритием за счет метилирования молекулы [3H]-метильной группой йодистого метила.
4. Основные радионуклиды в life science
Список радиоактивных изотопов, которые используются в life science, вообще крайне ограничен самой природой. В состав органических соединений входят водород, углерод, кислород, азот, а также гораздо реже фосфор и сера. Следовательно, для получения немодифицированных меченых соединений круг возможных радионуклидов ограничен этими биогенными элементами. Их характеристики приведены в таблице 1.
Радионуклид
Период полураспада
Удельная активность 100% изотопа
Тип распада
Энергия(max) [MeV]
[mCi/mmol]
[Бк/моль]
3H (тритий)
12.43 года
29.05
1,11x1015
в
0.0185
14C
5730 лет
0,062
2,3х1012
0.156
32P
14.3 дней
9104
0,33х1018
1.709
33P
25.4 дней
5138
0,19х1018
0.249
35S
87.4 дней
1491
0.5х1017
0.167
125I
60 дней
2167
0,8х1017
e.c.
0.25
К сожалению, радиоактивные изотопы кислорода и азота имеют совершенно неприемлемый для работы в life science период полураспада -- от нескольких минут до миллисекунд. Такие ультра короткоживущие изотопы (УКЖ) уже применяются в медицине и технике, однако их использование в физико-химической биологии весьма проблематично.
Перечень радионуклидов, которые могут использоваться (и используются) для получения модифицированных молекул, может быть существенно расширен. Такие модифицированные молекулы часто используются не только в life science, но и в медицине (как для диагностики, так и для терапии). Весьма популярны для медико-биологических работ радионуклиды технеция, хрома и других. В этом материале не будут рассматриваться медицинские аспекты применения меченых соединений, поэтому сосредоточимся на использовании радионуклидов, приведенных в таблице 1.
Следует заметить, что все радионуклиды из таблицы 1 являются в-излучателями, кроме 125I, который "затесался" в этот список скорее в знак "особых заслуг", о которых ниже будет отдельная глава. На самом деле 125I для меченых соединений практически не используется, так как в живых организмах особого разнообразия молекул, содержащих йод, не наблюдается.
Вообще, "идеальный радионуклид" для life science должен отвечать следующим критериям:
· Элемент должен входить в состав всех органических молекул. Это понятно, так как делает возможным введение "меченого атома" в любую молекулу.
· Период полураспада "идеального радионуклида" 10ч100 дней. Это будет соответствовать теоретической молярной активности в диапазоне 1018ч1017 Бк/моль и сможет обеспечить высокую чувствительность метода.
· Чистый в-излучатель с максимальной энергией излучения не более 0,4 Мэв.Это позволяет сравнительно просто детектировать радионуклид и в тоже время сохраняет высокое разрешение методов, связанных с авторадиографической детекцией меченых продуктов.
К сожалению, ни один из приведенных в таблице радионуклидов не соответствует "идеалу". Тритий и углерод имеют слишком большой период полураспада, т.е. низкую молярную активность (особенно, углерод), а очень низкая энергия излучения трития сильно осложняет его детекцию и радиометрию. Весьма удобные ядерно-физические характеристики радиоактивных изотопов фосфора и серы не могут компенсировать ограниченность распространения этих элементов в органических молекулах. Поэтому выбор радионуклида, который предполагается использовать для исследования, приходится делать с учетом разных факторов, которые подробно разбираются ниже.
Все приведенные в таблице радионуклиды -- искусственные, реакторные изотопы. В природе существуют радиоактивные изотопы 3H и 14C, но их содержание очень низкое, и препаративное выделение таких изотопов как сырья для синтеза меченых соединений является задачей с экономической точки зрения абсолютно разорительной. Кратко способы получения радионуклидов из таблицы 1 будут сообщены в соответствующих разделах.
5. Технические характеристики меченых соединений
Все препараты меченых соединений, которые используются в life science, имеют технические характеристики, подробно указанные фирмой-производителем в паспорте (сертификате) и кратко -- на флаконе с препаратом. Ниже подробно разбираются термины технических характеристик и их значение.
5.1. Радионуклидная чистота [ % ]
Это характеристика радиоизотопной чистоты препарата. Для большинства радионуклидов, применяемых в life science, не очень важна. Примеси других радионуклидов в тритиевых или 35S соединениях отсутствуют. Однако, для соединений, меченных фосфором-33, это важнейшая характеристика, т.к. часто наличие примеси фосфора-32 более 2ч3% делает препарат фосфора-33 весьма сомнительным по качеству с точки зрения многих методик.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7